ウェスタンブロットとは

ウエスタンブロッティングは、細胞抽出物または組織ホモジネートなどの試料から特定のタンパク質を検出するために使用される技術であり、in vitroで合成された組換えタンパク質も分析します。ウェスタンブロットはまた、特定の抗原とそれに対する抗体との間の特別な親和性に基づいて標的タンパク質を同定するために使用されることができます。ウエスタンブロットは、一般的に3つの主要なステップを含み、最初にSDS-PAGE、次いでサンプルのブロット、最後に免疫学的試験です。ウェスタンブロットにより、標的タンパク質に関する定性および半定量的データを取得することができます。タンパク質の分野では、ウェスタンブロットがタンパク質発現レベルの試験に広く用いられています。

ウェスタンブロットの原理:

•ウエスタンブロットは、目的の分子とプローブの間の結合の特異性に依存して、他の多くの同様の分子の混合物中の目的の分子を検出するイムノブロッティング技術です。
•ウエスタンブロットでは、目的の分子はタンパク質で、プローブは通常その特定のタンパク質に対する抗体です。
•SDS-PAGE技術はウエスタンブロットの前提条件です。

ウエスタンブロットのメリットとデメリット

メリット デメリット
• 高感度
• きれいで、容易に解釈できる出力
• 何千もの市販の抗体
• 変性タンパク質をテストしますので、機能状態の変化が検出られます(例:受容体リン酸化、アセチル化、メチル化など)。
• 速くない、やや労働集約的
• 組織は均質化する必要があります。

ウエスタンブロットに用いるおすすめの抗体

ウエスタンブロットに用いるエリートウサギモノクローナル抗体 (EliteRmab®)

Sino Biologicalは、ウサギ抗体ライブラリーの作製、ファージディスプレイによって高親和性を持つ抗原特異的抗体を選択することなど、ファージディスプレイ抗体ライブラリー技術における比類ない専門知識に基づいて、効果的なウサギモノクローナル抗体作製プラットフォームを構築しました。

ウサギモノクローナル抗体はどんなメリットがありますか。モノクローナル抗体は、伝統的に、特異抗原の免疫を獲得したマウスからのハイブリドーマ(ミエローマ細胞と脾臓細胞との融合細胞)によって産生されます。モノクローナル抗体を作製するための宿主としてマウスを使用することは、費用効果が高く、操作が容易です。しかしながら、研究者らはマウスモノクローナル抗体の問題、つまり制限に直面しています。第1に、多くの標的タンパク質はマウスとヒトとの間で非常に保存的であるため、マウス宿主によって自己抗原として認識される可能性があり、その結果、抗原の免疫原性が予想より低くなります。第2に、ウサギモノクローナル抗体と比較して、マウスモノクローナル抗体の親和性はより低く、したがって、標的タンパク質に結合する引力が弱いです。

二次抗体

二次抗体は、一次抗体または抗体断片に結合する抗体です。プローブとして標識された二次抗体は、検出、精製または細胞選別のアプリケーションに使用することができます。 二次抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり、Ig分子全体または抗体断片(例えばFcまたはFab領域)に特異的です。 特異的二次抗体は、通常、特定の実験室アプリケーションに使用されます。通常、いくつかの二次抗体はいずれも適切な特定の用途を有します。 二次抗体は、一次抗体の来源、一次抗体のクラス(例えば、IgMまたはIgG)、および好ましい標識の種類によって選択します。最適な二次抗体は通常、試行錯誤によって同定されます。 二次抗体は、免疫細胞化学、ELISA、ウエスタンブロット、免疫組織化学などの多くの生化学アッセイに非常に有用です。

ウエスタンブロット用のローディングコントロール抗体

ローディングコントロールは、通常、試験される細胞型またはサンプルで高レベルの構成的発現を示すタンパク質です。これにより、一定の発現レベルが保証されます。したがって、ローディングコントロールとしては、「ハウスキーピング遺伝子」が頻繁に選択されます。 ローディングコントロールとして選択されたタンパク質が目的のタンパク質とは異なる分子量を有することも重要であり、その結果、バンドが区別され、発現レベルが定量可能です。一般的なローディングコントロール検出抗体としては、anti-β-Actinモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、anti-COX-4、anti-GAPDH、anti-Tubulin およびanti-VDAC/Porin抗体が含まれます。

ウエスタンブロット用のタグ抗体

タグ抗体は、特定のタグ(例えばMyc、GST、GFP、His、HAなど)を有するタンパク質の発現を検出するのを容易にします。さらに、いくつかのタグ抗体は、タグ融合タンパク質の精製に使用することができます。Sino Biologicalは、手頃な価格で、現在の主要ブランドと比較して30-80%のコスト削減で、研究ニーズに合った高品質のタグ抗体を提供します。また、大口注文には大きな割引があります。

タグ抗体は、タンパク質発現の検出、または細胞局在化、およびタンパク質精製などの様々なアプリケーションに広く使用されています。Sino Biologicalは、多くのイムノアッセイ、ウエスタンブロット、ELISAなどで検証済の高品質のタグ抗体を提供します。

ウエスタンブロット用のアイソタイプコントロール抗体

アイソタイプコントロールIgGは、ELISA、ウエスタンブロット(WB)、免疫組織化学(IHC)および免疫沈降(IP)実験に必須です。その目的は、実験結果に染色されたタンパク質が抗体との特異的相互作用に起因すると推定することです。特異的な一次抗体のみを使用する人もいますが、これは、特定の抗原結合部位とは異なる免疫グロブリンの領域に結合し得るタンパク質を考慮していません。この非特異的結合は、Fc受容体結合または他のタンパク質 - タンパク質相互作用に起因します。最良の方法は、アイソタイプを一致させるコントロールで実験を行うことです。IgGアイソタイピングコントロールは、同じ免疫グロブリンサブタイプを有し、特異的検出抗体と同じ濃度で使用するべきです。Sino Biologicalは厳選された高品質のコントロールIgGを提供しています。