ウエスタンブロット: 10つのヒントと技術

ウエスタンブロット(タンパク質免疫ブロット法)は、タンパク質を検出および分析するための日常的な方法です。ただし、再現性があり信頼性のあるブロットを取得したい場合は、注意する点とヒントを知っておく必要があります。

Sino Biologicalでは、ウエスタンブロットに関する10年以上の経験があり、堅牢なデータ生成ときれいなブロットを確実にするための一連のヒントとテクニックを開発しました。

1 標的タンパク質および一次抗体の最良の使用方法を決定します。
文献と抗体の製造元がタンパク質ローディングおよび抗体希釈液に関する一般的なガイドラインを推奨していますが、目的タンパク質の相対的存在量と使用する抗体の力価は時々パラメータの更なる最適化を必要とします。一般に、1μg/ mLの一次抗体を含有する溶液で検出することは目的のタンパク質を含む1μgの精製タンパク質または10μgのライセートは十分です。にもかかわらず、細胞ライセート中の低い存在量のタンパク質について、50μgの総タンパク質および少なくとも2μg/ mLの抗体が必要です。逆に、これらのパラメータを他の方向に調整することによって高いバックグラウンドまたは望ましくない交差反応性を調節することも可能です。
2 タンパク質転写の効率を維持します。
ほとんどのタンパク質は、ウェット式転写システムに~14Vをアプライして一晩過ぎるか、またはセミドライ式システムに約0.8 mA/cm2のゲル面積の最大電流をアプライすることによって成功に転写できます。100kDaを超える大きなタンパク質や非常に疎水性のタンパク質などのタンパク質の場合、膜へ転写する効率の改善が必要です。セミドライシステムにより高出力で転写時間を延長することが可能ですが、約20℃の一定の転写温度を維持するために冷却が必要です。また、0.1%(w / v)の濃度のSDSを添加して、転写バッファーを改変することにより転写効率を高めることも可能です。ナイロンメンブレンを使用する場合は、SDSとメタノールを使用しないでください。
3 ウエスタンブロットにおけるゲルの厚さの影響を予測します。
ゲルの厚さはイムノブロッティングにおいて二重効果を有し、抗原検出の量と質の両方に影響を及ぼします。一般に、ゲルの厚さおよびアクリルアミドのパーセンテージは、タンパク質転写効率およびバンド拡散と逆相関し、0.5~0.75mmのゲルは、1.0~2.0mmのゲルよりもっと効率的に転写します。また、より薄いゲルからのタンパク質バンドは通常、より良好に分離し、きれいで明確な検出を提供します。
4 膜とゲルを転写バッファーで平衡化することを確保します。
転写する前に、転写緩衝液で10〜15分膜を平衡させることを常に覚えてください。PVDFメンブレンは疎水性であり、転写緩衝液に入れるだけで湿らないので、最初に100%メタノールに2秒間浸し、次に転写緩衝液で10〜15分間平衡化してください。メンブレンが乾燥した場合、再びメタノールで湿らせ、次に転写緩衝液で湿らせます。電気泳動後、転写緩衝液中で室温でゲルを30分間平衡させ、転写の間にゲルの大きさの変化を防ぐことを推奨します。ゲルの大きさの変化は通常ぼやけた転写パターンをもたらします。
5 適切なブロッキング剤によってバックグラウンドを減らします。
きれいなウエスタンブロットを得るには、最も重要なパラメータの1つは適切なブロッキング剤の選択です。Tween-20のような温和な洗剤(通常は0.05%〜0.5%(v / v))を補充した場合、ブロッキング溶液はよりよく作用します。ブロッキング剤は多くあり、免疫分析グレードの無脂肪乾燥粉乳、BSA fraction Vまたは正常動物血清が含まれ、作業濃度が0.5%〜5%(v / v)です。血清は一次抗体とブロッキング剤との間の非特異的相互作用を減少させられるため、問題のあるバックグラウンドにとって最良の解決策です。血清を使用する場合、一次抗体と同じ種由来でなければならなく、二次抗体検出を使用する場合、二次抗体と同じ種由来でなければなりません。
6 インキュベーション時間を最適化します。
一次抗体の効力は、抗原とのインキュベーション時間を最適化することによって利用することができます。 通常、目的のタンパク質を視覚化するには1時間のインキュベーションが十分ですが、4℃で一晩のインキュベーションは抗原抗体反応が起こり、陽性シグナルが検出されるには十分です。 室温での1時間のインキュベーションは、通常、標識二次抗体にとって十分であるが、検出中に高いバックグラウンドを生成する可能性があるので、3時間を超えてはなりません。
7 抗体が変性タンパク質を認識しないことがあります。
通常、あなたの抗体が他のイムノアッセイで働きますが、ウェスタンブロットでは働かない場合、ゲル電気泳動は非変性条件下で行われます。 タンパク質は通常、ゲル電気泳動の間に変性条件下で分離されるので、これは抗体が非変性タンパク質の構造エピトープを認識することによりタンパク質の検出を制限します。
8 リン酸化タンパク質のウエスタンブロット
リン酸特異的抗体を用いてイムノブロッティングを行う場合、緩衝液適合性、抗体特異性およびタンパク質存在量を考慮すべきです。
リン酸化抗体はミルク中のいくつかのタンパク質成分に結合する可能性があるため、Blottoまたはdry milkを含む他のブロッキング混合物の使用は不適切です。代わりに、BSAベースまたは代替のブロッキングバッファを選択することを考えてください。ホスホ検出に関連する一般的な問題は、ホスホ抗体が細胞ライセート中の低存在量のタンパク質を検出することができないことです。この問題は、ヒント9に記載されているような免疫沈降によって解決することができます。
9 微量タンパク質の検出
ウェスタンブロットによる低存在量のタンパク質の検出は、標的タンパク質の免疫沈降によって達成することができ、特定の免疫沈降抗体を用いて、より多くの目的のタンパク質をサンプルレーンにロードします。免疫沈降に使用されるライセートの量に依存して、この方法によってより強いシグナルが得られます。標的タンパク質は、HRP標識二次抗体と反応し、目的のタンパク質からのシグナルを不明瞭にする免疫沈降抗体の重鎖または軽鎖と共遊走することができるので、適格な試薬を使用する必要があります。
10 ストリッピングとリプロービングメンブレン
異なる抗体を用いていくつかのタンパク質を試験する際に同じ膜が必要な場合、各抗原 - 抗体相互作用が常に異なるので、特定のアッセイに経験的に最適化する必要があるかもしれないが、ストリッピングおよび再プローブが常に可能です。一般に、ストリッピング緩衝液は、残留する抗体を除去するために、低pH、界面活性剤、還元剤および/または熱を組み合わせた試薬です。反復的な再プロービングはシグナルの消失を招くことがあるが、一般的にはいくつかの再プロービングが可能です。ビオチン - ストレプトアビジン相互作用はこの方法で解離することはできないが、複合体全体を膜上の結合タンパク質から除去することができます。