ウエスタンブロットのタンパク質転写法

タンパク質がSDSによって提供される電荷で結合するように、タンパク質は電場の中でゲルから頑強な支持体上(ゲルからタンパク質を「ブロットする」という膜)に移動することができます。 これはウェスタンブロット転写と呼ばれます。 ここでは、ウェスタンブロット転写の方法、転写膜、一般的な転写バッファー、および転写の時間について検討します。

Protein transfer from gel to membrane in Western Blot
ウェスタンブロットにおいて、タンパク質をゲルから膜に転写します。

ウェスタンブロットにおけるセミドライ式転写とウェット式転写の比較

ウェット式およびセミドライ式転写は2つの最も一般的な電気泳動転写で、拡散、毛管作用、および真空に基づく代替法よりも優れた速度および効率を有します。ウエスタンブロット転写は、ウェットまたはセミドライの条件で行うことができます。一般に、セミドライ式ウエスタンブロット転写はより速いが、ウェット式ウェスタンブロット転写は失敗する傾向が少なく、100 kD以上の大きなタンパク質には特に推奨されます。ウェット式転写において、上の画像から、規則的な順序を有するサンドイッチのように見えるウェット式ウェスタンブロット転写モードが見られます。それは、中に気泡がなく、しっかりと固定されたスポンジ/紙/ゲル/膜/紙/スポンジのサンドイッチです。ゲルが負極に最も近く、膜が正極に最も近くすることは特に重要です。

ウエスタンブロット分離ゲル溶液のレシピ

  セミドライ式転写 ウェット式転写
転写の時間 <1 h 1時間から一晩まで
必要なバッファー容量 小さい 大きい
転写の効率 低い 高い
大きいタンパク質 適しない 適する
小さいタンパク質 適する 適する
膜上のバンド 不明瞭なバンドを生み出す傾向がある はっきりした、くっきりしたバンド

ニトロセルロースとPVDF(ポリフッ化ビニリデン)の2種類の基本的なトランスファーメンブレンがあります。ウエスタンブロットでは、標的タンパク質分子のサイズに応じて0.2μmまたは0.45μmの細孔径の膜を選択することができます。ほとんどのアプリケーションにとっては、PVDFとニトロセルロースは同等です。 PVDFはニトロセルロースより能力が高いが、より注意深い前処理が必要です。ゲルのサイズに応じて膜を適切なサイズにカットし、通常はゲルよりも少し大きめです。メタノールに約30秒間浸します。ddH<sub>2</sub>Oで約1分間洗浄した後、氷冷転写緩衝液中で5分間インキュベートします。ゲルはまた、氷冷転写緩衝液中で3〜5分間平衡化する必要があります。

ウェスタンブロット用の転写バッファー

ウェスタンブロットにおいて二つの最も一般的な転写バッファー のレシピ:

1X 転写バッファー ()ウェット式 1.0 Lの場合: 3.0 g Tris-base
14.4 g グリシン
200 mL メタノール
1X 転写バッファー (セミドライ式) 1.0 Lの場合 5.76 g Tris-base
2.95 g グリシン
200 mL メタノール
ddH2O を1 Lまで加える。 ddH2O を1 Lまで加える。

ウエスタンブロット転写バッファーにおけるメタノールとSDSの役割は何ですか?

転写バッファー中のメタノールはゲルの膨張を防ぎ、タンパク質の膜への結合効率(特にニトロセルロース)を向上させます。 しかしながら、それはまたゲル孔径の縮小、タンパク質電荷の変化、およびタンパク質沈殿を引き起こすことができます。したがって、実験条件に応じてメタノール濃度を調整することをお勧めします。 メタノールを添加しても転写効率はそれほど向上しないことがわかっているため、一部の実験室では、20%メタノールを10%エタノールに置き換えます。

通常のウエスタンブロッティング実験では、SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を転写バッファーに添加しべきではありません。 通常、以前のSDS-PAGE工程では、ゲルから膜へ効果的に転写するために、タンパク質は十分なSDSと結合しています。 しかしながら、タンパク質が沈殿する傾向があるか、または大きなタンパク質の場合、ウエスタンブロット転写バッファーにはSDSが必要です。

ウェスタンブロットの転写時間と電流

転写バッファーにおけるSDSとメタノールのバランス、タンパク質サイズ、およびゲルパーセンテージは転写の効率に影響する主な要因です。ウェスタンブロットの電流および転写時間については、適切な電流および転写時間を選択することはウェスタンブロットをうまく行うことにとって特に重要です。電流が低すぎるか、または転写時間があまり短い場合、転写が不完全になります。逆に、電流が高すぎるか、または転写時間が長すぎると、タンパク質が吸収されずに膜を通過する可能性があり、特に小分子量タンパク質の場合に起こります。

転写されるタンパク質の分子量 VS ウェスタンブロットの転写時間

分子量(kDa) 転写の時間と電流
< 20 1 Aの定電流で45分、または、転写する効率が同じな他の方法(250 mAで3時間、または500 mAで90分)
20 -120 1 Aの定電流で1時間、または、転写する効率が同じな他の方法(250 mAで4時間、または500 mAで2時間)
120 - 250 1 Aの定電流で90分、または、転写する効率が同じな他の方法(250 mAで6時間、または500 mAで3時間)
> 250 1 Aの定電流で90分、または、転写する効率が同じな他の方法(500 mAで3.5時間)

WBにおける大きいタンパク質と小さいタンパク質の転写

大きいタンパク質の場合(>100 kD)

1 ぜひ低濃度(8%またはそれ以下)のゲルでサンプルの泳動を行ってください。最終濃度が0.1%になるまで、転写緩衝液中にSDSを添加することにより、ゲル中のタンパク質沈殿の可能性を低くすることができます。
2 メタノールはタンパク質からSDSを取り除く傾向があるので、メタノールの割合を10%または10%以下にすることで沈殿を防ぐことができます。
3 メタノールはニトロセルロースを使用する場合にのみ必要です。 PVDFを使用する場合は、メタノールを転写バッファーから完全に取り除くことができます。正しい順序に従ってゲル/膜という「サンドイッチ」を組み立てる前に、PVDFをメタノールで活性化する必要があります。
4 ウェスタンブロットセミドライ転写ではなく、4℃で一晩、ウエスタンブロットウェット式転写を選択します。

小さいタンパク質の場合(<100 kD)

1 トランスファーバッファーからSDSを除去し、メタノール濃度を20%に保つことをご検討ください。
2 ニワトリ抗体はPVDFおよび他のナイロンベースの膜に結合する傾向があるため、高いバックグラウンドをもたらします。ニトロセルロースメンブレンに切り替えることにより、バックグラウンド染色を減らすことが可能です。