ウェスタンブロット解析用の試料調製

ウェスタンブロット試料調製はSDS-PAGEの前に行い、ウェスタンブロットの始まりです。試料抽出物は、ホモジナイゼーションおよび超音波処理法や高圧破砕のような機械的破砕によって細胞培養液または組織から調製することができます。その後、溶解バッファーでさらに溶解させ、最大パーセントのタンパク質が抽出されたことを確認します。タンパク質の分解を防ぐために、抽出は常に氷上または4°C で行われます。

Procedures for Western blotting cell lysis
ウエスタンブロッティング細胞溶解の手順
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サンプルに適した溶解バッファーを選択してください

サンプルに適した溶解バッファーを選択することが、ウエスタンブロットの成功への第一歩です。 不適切な溶解バッファーを使用すると、目的のタンパク質が完全に抽出できない、またはほとんど抽出できない可能性があります。 そのため、目的のタンパク質の発現位置に基づいて、適切な溶解バッファーを選択することは、この問題を回避することができます。

タンパク質の位置 おすすめのバッファー
全細胞 NP-40
核 / ミトコンドリア 目的タンパク質濃度を高めるためのRIPA、または核/ミトコンドリア分画
細胞質(可溶性) Tris-HCl バッファー
細胞質(細胞骨格結合型) Tris-Triton バッファー
膜結合型 NP-40, RIPA or Tris-Triton バッファー
溶解バッファーのレシピを詳しく知りたい場合は、「ウエスタンブロット用バッファー/試薬の調製」ページをご覧ください。

プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤を忘れないように注意してください

プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加することにより、サンプル調製中に漏れたプロテアーゼによる消化からタンパク質を保護することができます。

阻害剤 構造式 MW (Da) 阻害剤の特異性 溶解度 (溶剤) 作業濃度
アプロチニン - 6512 キモトリプシン、プラスミン、トリプシン、およびカリクレイン 10 mg/mL (H2O) 0.01 – 0.3 µM
キモスタチン Chymostatin structural formula 604.7 セリンプロテアーゼ 20 mg/mL (DMSO)
20 mg/mL (氷酢酸)
10 – 100 µM
ベスタチン Bestatin structural formula 308.4 アミノペプチダーゼB、ロイシンアミノペプチダーゼおよびアミノペプチダーゼN 5 mg/mL (メタノール)
20 mg/mL (1 M HCI)
1 mg/mL (0.15M NaCl)
130 µM
E-64 E-64 structural formula 357.4 システインプロテアーゼ 25 mg/mL (DMSO)
20 mg/mL (aqueous buffers)
1.4 – 28.0 mM
ロイペプチン Leupeptin structural formula 426.6 セリン、プラスミン、ブタカリクレインおよびシステインプロテアーゼ 1 mg/mL (H2O) 1 µM
PMSF PMSF structural formula 174.2 システインおよびセリンプロテアーゼ 18 mg/mL (メタノール) 0.1 – 1.0 mM
ペプスタチン A Pepstatin A structural formula 685.9 アスパラギン酸プロテアーゼ 1 mg/mL (エタノール)
1 mg/mL (メタノール)
300 μg/ml (6 N 酢酸)
1 – 20 µM
EDTA EDTA structural formula 372.24 メタロプロテアーゼ 0.5 M (H2O) 0.5 – 1.3 mM
AEBSF•HCl AEBSF•HCl structural formula 239.7 キモトリプシン、カリクレイン、プラスミン、トロンビンおよびトリプシン 200 mg/mL (H2O) 0.1 – 1 mM
* 実験条件に適した濃度は最適化する必要があります。

タンパク質濃度を測定するタンパク質アッセイ法

各レーンのローディング量が均等であることを確保するために、タンパク質濃度の測定は避けられません。 タンパク質の生化学的分析は、タンパク質濃度の正確な定量化に依存しています。Lowryアッセイ、Bradfordアッセイ、BCAアッセイ、およびUV分光法など、生化学実験室でタンパク質濃度を測定するにはいくつかの一般的なタンパク質アッセイ法があります。 実験条件に応じて、1つのアッセイを行うことによってタンパク質濃度を決定することができます。

サンプルの組成 推奨されないタンパク質アッセイ 推奨タンパク質アッセイ
アルギニン-リッチプロテイン Bradford アッセイ Lowry、BCA または UV アッセイ
システイン-リッチプロテイン BCA アッセイ Lowry、UV または Bradford アッセイ
トリプトファン- または チロシン-リッチ( 吸光係数がない) UV アッセイ Lowry、BCA またはBradford アッセイ

PAGEゲルにロードする前のサンプル調製

タンパク質濃度の測定後、試料をゲルローディング緩衝液(2x Laemmli試料緩衝液とも呼ばれる)中に希釈します。この緩衝液にはグリセロールとトラッキングダイ(ブロモフェノールブルー)が含まれます。グリセロールはサンプルがゲルのウェルに容易に沈むのを助けます。トラッキングダイはゲルの底に達し、これは電気泳動の終わりを示します。

PAGEゲルにロードする前に、変性を助けるために、サンプルを100℃で5分間、または70℃で10分間加熱します。この際、サンプルをすぐにゲルにロードすることも、後で分析するために4℃または-20℃に放置することができます。

例: ウエスタンブロット用の接着細胞のサンプル調製

1 冷たいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加え、穏やかに振盪することにより、組織培養フラスコまたはディッシュ中の細胞を洗浄します。 PBSを捨てます。 (コツ:組織培養ディッシュを常に氷上に置いてください)。
2 PBSを加え、細胞スクレーパーを使用して細胞を除去します。 混合物をマイクロ遠心チューブにピペットします。
3 1500 RPMで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
4 氷冷の細胞溶解バッファー180μLを、20μLの新鮮なプロテアーゼ阻害剤カクテルと共に添加します。(コツ:タンパク質の濃度が最終的に十分高くない場合は、より高い割合のプロテアーゼ阻害剤カクテルで手順を繰り返すことをお勧めします)。
5 氷上で30分間インキュベートし、4℃、12,000 RPMで10分間回転させて、ライセートを清澄化します。
6 上清(またはタンパク質混合物)を新しいチューブに移し、氷上で保存するか、-20℃または-80℃で凍結してください。
7 分光光度計を用いてタンパク質の濃度を測定します。
8 公式 "濃度=質量/容量"を使用して、タンパク質抽出物の容量を決定し、各ウェルが50μgであることを確保します。
9 5μLのサンプルバッファーをサンプルに加え、2回蒸留H2O (dd H2O)を用いて各レーンの容量を等しくします。よく混ぜます。(コツ:推奨される総容量はレーンあたり15μL)。
10 サンプルを100℃で5分間ドライプレートで加熱します。