ウエスタンブロット用のタンパク質検出法

ウェスタンブロット抗体の検出手順は大きく異なります。 1つの共通の差異は、直接検出法および間接検出法に関与するということです。直接検出法において、ブロット上の抗原を検出するために使用される一次抗体を蛍光色素または酵素で標識します。間接検出法は大部分の研究者に好まれ、直接検出法は広く用いられていません。直接検出法において、抗原に結合するために、まず1つの一次抗体(モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体)、次は一次抗体に対する標識二次抗体を添加します。標識には、ビオチン、フルオレセインまたはローダミンなどの蛍光プローブ、およびアルカリホスファターゼ(AP)または西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)などの酵素コンジュゲートが含まれます。直接検出法と比べて、間接検出法は多くの利点を有します。

3つのウエスタンブロット検出法から最も適した方法を選びましょう!

  発色ウェスタンブロット 化学発光ウェスタンブロット 蛍光ウェスタンブロット
結果 Chromogenic Western Blot Chemiluminescence Western Blot Fluorescent Western Blot
検出の種類 発色 化学発光 蛍光
感度 + ++++ ++
マルチチャンネル発色 No No Yes
定量的方法 定量的ではない 半定量的 定量的
シグナルの安定性 数ヶ月 数時間 数ヶ月
基質 HRPシステムの場合: 4CN / DAB / TMB
APシステムの場合: BCIP / NBT
ルミノール 必要としない
検出法 目測 X-ray フィルム, CCDカメラ 蛍光デジタルイメージャー, 近赤外イメージングシステム

ウェスタンブロット抗体の検出手順は次のとおりです。結合していない二次抗体を洗い流し、酵素基質を膜と共にインキュベートします。すると、膜結合の二次抗体の位置が発光するようになります。検出された目的のタンパク質に対応するバンドは現像したフィルム上に暗領域として現れます。異なるレーンのバンド密度を比較することにより、目的のタンパク質の相対存在量に関する情報が得られます。

新世代のフィルム現像液は、エンクロージャー内にカメラを内蔵したユニットで、暗室は必要としません。カメラは膜から発出した化学発光を検出し、信号をデジタル画像に変換します。このように、検出マシンに付属のソフトウェアで迅速に分析することができます。

ウェスタンブロットにおける間接 VS 直接検出法

  間接検出 直接検出
  indirect detection western blot direct detection western blot
メリット • 二次抗体はシグナルを増幅させることが可能。
• 一連の標識二次抗体が利用可能。
• 1つの二次抗体は多くの一次抗体に利用可能。
• 標識は一次抗体の免疫反応性に影響しません。
• 二次抗体の変更は検出法の変更を可能にします。
• 一次抗体しか必要としないため、もっと速いです。
• 一次抗体は異なるラベルで標識することができます。
デメリット • 二次抗体は非特異的なバンドをもたらす可能性があります。
• 直接検出と比べ、追加の手順が必要です。
• 標識は一次抗体の免疫反応性を減少させる可能性があります。
• 標識一次抗体は高価です。
• 一次抗体ラベルの選択において柔軟性が低いです。
• 信号の増幅がより少ないです。