ウエスタンブロット用のバッファーおよび試薬の調製

ウェスタンブロットでは、試料調製に必要な溶解緩衝液を除き、他の試薬を調製する必要もある。SDS-PAGEにはローディングバッファー、泳動バッファー、クマシーブリリアントブルー染色溶液、クマシー脱色液を準備する必要があるが、ウェスタンブロット転写バッファー(ここのレシピはウェット式転写用)はタンパク質転写に必要である。場合によっては、ponceau red stainingはタンパク質の転移が成功したかどうかを確認するための代替手段であるため、ponceau red staining溶液のレシピが必要である。また、TBSバッファー、ブロッキングバッファー、TBSTバッファー(洗浄バッファー)も準備する必要がある。以下の表は、特にウェスタンブロットに必要なバッファーまたは試薬に関するレシピであり、この表を「ウェスタンブロットのバッファレシピ」と名付けることができる。

ウエスタンブロット用バッファーのレシピ

バッファーカテゴリー バッファー名 レシピ
基本的なバッファー 10X TBS バッファー (pH 7.6) 1.0 Lの場合: 24.2 g Tris-base
87.8 g NaCl
pHを7.6に調整する。ddH2O を1 Lまで加える。
10X PBS バッファー (pH 7.4) 1.0 Lの場合: 80.0 g NaCl
2.0 g KCl
14.4 g Na2HPO4
2.4 g KH2PO4
pHを7.4に調整する。ddH2O を1 Lまで加える。
細胞溶解バッファー NP-40 溶解バッファー 150 mM NaCl
50 mM Tris-HCl, pH 8.0
1.0% NP-40 or Triton X-100

Add fresh protease inhibitors before use.
RIPA (放射性免疫沈降法) 溶解バッファー 140 mM NaCl
10 mM Tris-HCl, pH 8.0
1 mM EDTA
0.5 mM EGTA
1% Triton X-100 or NP40
0.1% sodium deoxycholate
0.1% SDS

使用前に新鮮なプロテアーゼ阻害剤を添加してください。
Tris–Triton lysis buffer 140 mM NaCl
10 mM Tris-HCl, pH 8.0
1 mM EDTA
0.5 mM EGTA
1% Triton X-100 または NP40
0.1% デオキシコール酸ナトリウム
0.1% SDS

使用前に新鮮なプロテアーゼ阻害剤を添加してください。
SDS-PAGE バッファー& 溶液 2X Laemmli ローディングバッファー(還元) 120 mM Tris-HCl, pH 6.8
4% SDS
20% グリセロール
10% 2-メルカプトエタノール

使用前にブロモフェノールブルーを最終濃度0.02%(w/v)まで添加する。
SDS-PAGE 10X 泳動バッファー 1.0 Lの場合: 30.0 g Tris base
144.0 g グリシン
10.0 g SDS
pHを調整しないでください!
ddH2O を1 Lまで加える。
クマシーブリリアントブルー溶液 1.0 Lの場合: 1.0 g クマシーブリリアントブルー
400 mLメタノール
100 mL 酢酸
ddH2O を1 Lまで加える。
クマシー脱色液 1.0 Lの場合: 200 mL メタノール
100 mL 酢酸
Add ddH2O to 1 L.
転写バッファー& 溶液 ウエスタンブロット1X 転写バッファー(ウェット) 1.0 Lの場合: 3.0 g Tris-base
14.4 g glycine
200 mL methanol
ddH2O を1 Lまで加える。
ウエスタンブロット1X 転写バッファー(セミドライ) 1.0 Lの場合: 5.76 g Tris-base
2.95 g グリシン
200 mL メタノール
ddH2O を1 Lまで加える。
ポンソーS 染色液 1.0 Lの場合: 0.5 g ポンソー S
25 mL 酢酸
ddH2O を1 Lまで加える。
ウエスタンブロット洗浄バッファー 1X PBST (リン酸緩衝生理食塩水、0.1% Tween 20) 1.0 Lの場合: 100 mL 10X PBS
899 mL ddH2O
1 mL Tween 20
1X TBST (トリス緩衝食塩水、0.1% Tween 20) 1.0 Lの場合: 100 mL 10X TBS
899 mL ddH2O
1 mL Tween 20
ブロッキングバッファー ウエスタンブロットブロッキングバッファー 5% (または 3%) 脱脂粉乳または BSA 含有1X TBSTまたは1X PBST.