二次抗体

二次抗体の全リスト

二次抗体は、特異的一次抗体が最初に結合する標的抗原の間接的な検出に使用される。 検出可能な一次抗体を使用するよりも多くの工程を必要とするが、標的抗原の間接的な検出は、単一の一次抗体に結合する複数の二次抗体からのシグナル増幅のため、高感度というメリットを有する。 二次抗体は、標的抗原に直接結合する一次抗体に結合することによって標的抗原の検出、選別または精製を助ける。

一次抗体のFabドメインは一つの抗原に結合し、そのFcドメインを二次抗体に暴露する。 次に、二次抗体のFabドメインは、一次抗体のFcドメインに結合する。 抗体のFcドメインは同じ動物クラス内で一定であるので、多くの種類の一次抗体に結合するには1種類の二次抗体しか必要としない。 これより、様々な種類の一次抗体を標識するのではなく、一種類の二次抗体のみを標識することによってコストを低減することが可能である。

二次抗体は、抗体種と使用されている一次抗体のアイソタイプに特異性を有さなければならず、一般に、検出可能なタグまたは検出または精製を容易にする他の標識を有する。 大部分の一次抗体はわずかの宿主動物種において産生され、抗体のほぼすべてがIgGクラスであるため、製造業者はほとんどの方法と検出システムに適用し、すぐに使用できる二次抗体を製造し供給することが容易で経済的である。

二次抗体は、通常ポリクローナル抗体であり、宿主動物を異なる種の抗体で免疫することによって生成する。 例えば、ヤギ、ロバ、ヒツジおよびニワトリのようなマウス以外の種にウサギ抗体を注入することによって抗ウサギ抗体を生成する。 最も一般的なタイプの二次抗体は、標的種からの免疫グロブリン集団に対して生成したものである。 標的抗原が全IgGである場合、生成した二次抗体は、全てのクラス、重鎖および軽鎖(H&L)および標的IgGのフラグメントならびに同じ保存ドメインを共有する他の分子(例えば、IgMはIgGと同じκ軽鎖を共有する)に結合することができる。

対照的に、マウスIgG1抗体のみでヤギを免疫化すると、マウスIgG1抗体に特異的な抗体および同じ保存ドメインを共有する分子が生成される。 多くの免疫グロブリンドメインの構造における高度の保存のため、他の免疫グロブリンとの交差反応を最小限にするためには、クラス特異的二次抗体はアフィニティ精製および交差吸着しなければならない。 上記の例を用いて、固定化マウスIgG1抗体を使用して、マウスIgG1に結合するすべてのヤギ抗体をアフィニティ精製する。 次いで、これらの抗マウスIgG1抗体を、マウスIgG2a、IgG2b、IgG3、IgMなどを含むクロマトグラフィーカラムを通過させて精製して、非IgG1アイソタイプと交差反応するすべての抗体を除去する。

さらに、二次抗体は、宿主を免疫化するために使用される種以外の種からの固定化血清タンパク質を含有するカラムを通すことによってさらに精製することができる。 この交差吸収法(「交差吸着」と呼ばれる)は追加の精製工程であり、複数の種からの一次抗体を使用する場合およびプローブされる試料中に免疫グロブリンまたは他の血清タンパク質が存在する場合に推奨される。 免疫沈降(IP)サンプルのウェスタンブロットでは、一次抗体(重鎖および軽鎖)バンドを最小限に抑えるために、二次抗体を変性一次抗体を含むカラムに通す必要がある。

異なる用途に応じて、二次抗体はwhole IgG、F(ab') 2フラグメント、およびFabフラグメントという3つの異なる形態で提供される。 さらに、特定の方法において、典型的な二次抗体は、あまりにも特異的である(例えば、一次抗体の1つの宿主種のみを認識する)か、またはあまり一般的である(例えば、whole IgGおよびその任意のフラグメントを認識する)。 二次抗体はまた、一次抗体全体または特定の配列を認識するように設計される。

Anti- whole IgG (H+L)
これらの抗体は、IgG分子の重鎖および軽鎖、すなわちIgGのFcおよびF(ab')2 / Fab部分と反応する。 抗IgG (H+L)抗体は、すべて同じ軽鎖(κまたはλ)を共有するので、他の免疫グロブリンクラス(IgM、IgA、IgD、IgE)およびサブクラスとも反応する。 抗IgG (H+L)抗体は、抗フラグメント特異的抗体よりも広いエピトープ認識を有する。 これらはすべての一般的な免疫検出手順に推奨される。

Anti-IgG, Fc/Fcγ フラグメント特異的

これらの抗体は、IgG重鎖のFc部分と反応する。それらはELISAによって試験され、および/またはFabフラグメントに対して吸収済である。IgMおよび/またはIgAとの交差反応性を最小限に抑えるために、それらをさらに試験および/または吸着する場合がある。 このような場合(抗ヒト、抗マウスおよび抗ラット)、それらは「抗IgG、Fcγ」と標識される。

ご注意:抗IgG、Fcγフラグメント特異的抗体は、すべてのモノクローナルIgGと等しく反応しないことがある。 IgGの4つのサブクラスに対してバランスの取れた反応性を有する抗マウスIgG、Fcγフラグメント特異的抗体について、ヤギ抗マウスIgG(サブクラス1+2a+2b+3)、Fcγフラグメント特異的(min X Hu, Bov, Rb Sr Prot)を選択してください。

抗マウスIgG, Fcγサブクラス特異的

これらの抗体は、マウスIgGの個々のサブクラスの重鎖のFc部分と反応する。他のサブクラス、Fabフラグメント、IgA、IgM、および他のいくつかの種類のIgGとの交差反応性を最小限にするために、それらはELISAによって試験され、および/または吸着済である。 抗マウスIgG、Fcγサブクラス特異的抗体は、複数の標識を有する実験でマウスIgG一次抗体の異なるサブクラスを区別するために使われる。

Anti-IgG, F(ab')2 サブクラス特異的

これらの抗体は、IgGのF(ab')2 / Fab部分と反応する。それらはELISAによって試験され、および/またはFcフラグメントに対して吸収済である。それらは軽鎖と反応し、したがって同じ軽鎖を共有する他の免疫グロブリンクラス(IgA、IgM、IgD、およびIgE)およびサブクラスとも反応するため、IgGに特異的ではない。

ほとんどの場合、これらの制限は、実験システムを慎重に設計し、適切な二次プローブを選択することによって克服することができる。 以下の情報は、特定のアプリケーションに適した二次抗体を選択するのに役立つ。

1.一次抗体の種を決定する
二次抗体は、一次抗体の種に直接的に対するものである。 したがって、一次抗体の宿主種とは異なる種で産生した二次抗体が必要となる。 例えば、一次抗体がマウスで産生された場合、ヤギ、ウサギなどで産生された抗マウス二次抗体が必要である。二次抗体に適した宿主種を選択する(ヤギ抗マウスIgG、ロバ抗ウサギIgG )。複数の標識を有する実験において、いくつかの宿主種は他の種と適合しないかもしれない。 一般に、すべての二次抗体は、複数の標識のために同じ宿主種に由来すべきである。

2.二次抗体の交差反応性や特異性の問題を考慮する
いくつかの宿主種からの抗体は、交差反応する目的種に吸着されないことがある。 必要な吸着を持つ宿主種を選択してください。多重標識アプリケーションまたは内在性抗体を有するサンプルを使用する場合、高度に交差吸収される抗体は必要である。

3.特異性 - 一次抗体の正しいフラグメント、サブタイプ、クラスまたは鎖に結合する
この質問は、モノクローナル抗体を扱う場合には特に重要である。 しかしながら、ポリクローナル抗体は、典型的には、IgGクラス免疫グロブリンである。このため、二次抗体は主に抗IgG抗体である。場合によっては、一次モノクローナル抗体がマウスIgMであれば、マウスIgM(抗マウスIgM)と反応する二次抗体が必要である。

一次モノクローナルがマウスIgGサブクラスの1つである場合、ほとんどすべての抗マウスIgG二次抗体はそれに結合すべきである。 一次抗体のサブクラスが分からない場合、それらはほとんどのマウス免疫グロブリンサブクラスを認識するので、抗マウスIgG F(ab)二次抗体を使用することができる。

4.検出または精製方法
標識物- 選択した検出方法に適した正しい酵素、タグまたはフルオロフォアに適切に結合する。標識物はアプリケーションに非常に依存している。イムノブロッティングおよびELISAでは、酵素標識二次抗体が最も一般的である。ペルオキシダーゼは、一般に、アルカリホスファターゼより経済的でより安定な酵素である。それはまた、化学発光検出システムでよく使われる。一方、アルカリホスファターゼは、特に比色検出を使用する場合、ペルオキシダーゼよりも感度が高いと考えられる。細胞または組織染色では、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼまたは蛍光色素標識二次抗体を使用することができる。関連するアプリケーションは、免疫細胞化学/免疫蛍光、フローサイトメトリー、または免疫組織化学である。

増幅を増加させるために、2段階のビオチン/アビジン系を使用することができる。ビオチンは非常に高い親和性でアビジンに結合し、本質的に不可逆的な相互作用を生じる。ビオチン化二次抗体を最初に、次にアビジンとExtrAvidinをアプライする。 または、酵素または蛍光色素で標識したストレプトアビジンは、ビオチン化二次抗体上の複数の部位に結合し、こうしてシグナルを増幅し、抗体 - 酵素または抗体 - 蛍光色素複合体単独で達成した感度よりも高い感度が得られる。

プロテインA、プロテインGまたはプロテインLに結合する能力–選択した二次抗体が上流または下流で使用する分子に対して十分な親和性を有することを確認してください。アフィニティー単離された二次抗体は非特異的結合が最も少ないため、ほとんどの人に好まれる。しかしながら、特定の場合には、IgG分画を考慮してもよく、すなわち、目的抗原がまれであるか、または存在量が低い場合。これらの状況では、高親和性抗体が必要である。吸着済抗体を使用することにより、組織および細胞を用いて作業する場合の非特異的バックグラウンドを減少させられる。このプロセスは、潜在的に交差反応する種からの固定された血清タンパク質上に二次抗体を通過させることを含む。したがって、ヒトの組織で作業する場合は、ヒト血清またはヒトIgGに吸着した二次抗体を選択してください。

5.提供する二次抗体への要求を考える。
提供状態:滅菌液体または凍結乾燥、PBSまたはトリスバッファー中に懸濁させ、ゼラチンまたはアルブミンなどのキャリアタンパク質、またはスクロースまたは微生物阻害剤などの安定剤を添加する。

ヤギ二次抗体

Goat Anti-Human IgG-Fc 抗体 Goat Anti-Rat IgG 抗体
Goat Anti-Human IgG 抗体 Goat Anti-Mouse IgG-Fc 抗体
Goat Anti-Rabbit IgG-Fc 抗体 Goat Anti-Mouse IgG 抗体
Goat Anti-Rabbit IgG 抗体  

ウサギ二次抗体

ウサギ Anti-Mouse IgM 抗体 ウサギ Anti-Human IgG Fc 抗体
ウサギ Anti-Mouse IgG 抗体  

マウス二次抗体

マウス Anti-Human IgG 抗体 マウス Anti-Human IgG Fc 抗体

HRP標識二次抗体

Goat Anti-Human IgG-Fc 抗体 Goat Anti-Mouse IgG 抗体
Goat Anti-Human IgG 抗体 ウサギ Anti-Mouse IgM 抗体
Goat Anti-Rabbit IgG-Fc 抗体 ウサギ Anti-Mouse IgG 抗体
Goat Anti-Rabbit IgG 抗体 マウス Anti-Human IgG 抗体
Goat Anti-Rat IgG 抗体 マウス Anti-Human IgG Fc 抗体
Goat Anti-Mouse IgG-Fc 抗体 ウサギ Anti-Human IgG Fc 抗体

ビオチン標識二次抗体

Goat Anti-Human IgG-Fc 抗体 Goat Anti-Mouse IgG 抗体
Goat Anti-Human IgG 抗体 ウサギ Anti-Mouse IgM 抗体
Goat Anti-Rabbit IgG-Fc 抗体 ウサギ Anti-Mouse IgG 抗体
Goat Anti-Rabbit IgG 抗体 マウス Anti-Human IgG 抗体
Goat Anti-Rat IgG 抗体 マウス Anti-Human IgG Fc 抗体
Goat Anti-Mouse IgG-Fc 抗体 ウサギ Anti-Human IgG Fc 抗体

ALP標識二次抗体

Goat Anti-Human IgG-Fc 抗体 Goat Anti-Mouse IgG 抗体
Goat Anti-Human IgG 抗体 ウサギ Anti-Mouse IgM 抗体
Goat Anti-Rabbit IgG-Fc 抗体 ウサギ Anti-Mouse IgG 抗体
Goat Anti-Rabbit IgG 抗体 マウス Anti-Human IgG 抗体
Goat Anti-Rat IgG 抗体 マウス Anti-Human IgG Fc 抗体
Goat Anti-Mouse IgG-Fc 抗体 ウサギ Anti-Human IgG Fc 抗体

FITC標識二次抗体

Goat Anti-Human IgG-Fc 抗体 Goat Anti-Mouse IgG 抗体
Goat Anti-Human IgG 抗体 ウサギ Anti-Mouse IgM 抗体
Goat Anti-Rabbit IgG-Fc 抗体 ウサギ Anti-Mouse IgG 抗体
Goat Anti-Rabbit IgG 抗体 マウス Anti-Human IgG 抗体
Goat Anti-Rat IgG 抗体 マウス Anti-Human IgG Fc 抗体
Goat Anti-Mouse IgG-Fc 抗体 ウサギ Anti-Human IgG Fc 抗体

PE標識二次抗体

Goat Anti-Human IgG-Fc 抗体 Goat Anti-Mouse IgG 抗体
Goat Anti-Human IgG 抗体 ウサギ Anti-Mouse IgM 抗体
Goat Anti-Rabbit IgG-Fc 抗体 ウサギ Anti-Mouse IgG 抗体
Goat Anti-Rabbit IgG 抗体 マウス Anti-Human IgG 抗体
Goat Anti-Rat IgG 抗体 マウス Anti-Human IgG Fc 抗体
Goat Anti-Mouse IgG-Fc 抗体 ウサギ Anti-Human IgG Fc 抗体

APC標識二次抗体

Goat Anti-Human IgG-Fc 抗体 Goat Anti-Mouse IgG 抗体
Goat Anti-Human IgG 抗体 ウサギ Anti-Mouse IgM 抗体
Goat Anti-Rabbit IgG-Fc 抗体 ウサギ Anti-Mouse IgG 抗体
Goat Anti-Rabbit IgG 抗体 マウス Anti-Human IgG 抗体
Goat Anti-Rat IgG 抗体 マウス Anti-Human IgG Fc 抗体
Goat Anti-Mouse IgG-Fc 抗体 ウサギ Anti-Human IgG Fc 抗体
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