サンドイッチ ELISA プロトコール

1.アッセイの前に、二つの抗体調製物をすべて精製する必要がある。そして、1つを標識しなければならない。

2.ほとんどのアプリケーションは、ポリ塩化ビニル(PVC)マイクロタイタープレートが最適であるが、タンパク質結合のための最も適切なタイプのプレートを決定するために、メーカーのガイドラインを参照してください。

3.各ウェルに約50μLの抗体溶液(20 μg/ml in PBS)を添加することにより、未標識抗体を各ウェルの底に結合させる。PVCは約100ng/ウェル(300ng/cm2)で結合する。使用する抗体の量は個々のアッセイに依存するが、最大限の結合が必要な場合は、少なくとも1μg/ウェルを使用してください。これはウェルの能力をはるかに上回るが、結合がより迅速に行われ、結合溶液を保存して再び使用することができる。

4.プレートを4℃で一晩インキュベートし、完全に結合させる。

5. ウェルをPBSで2回洗浄する。500mlの噴出ボトルが便利である。抗体溶液洗浄液は、適切な容器上でプレートをフリックすることによって除去することができる。
取り扱い上のご注意

6. マイクロタイタープレート上の残りのタンパク質結合部位は、ブロッキング緩衝液と共にインキュベートすることによって飽和させなければならない。0.02%アジ化ナトリウムを含む3%BSA / PBSでウェルを上部に満たす。室温で湿度の高い環境で2時間から一晩までインキュベートする。
注意:アジ化ナトリウムは阻害剤または西洋ワサビペルオキシダーゼである。HRP標識抗体を検出に使用する場合、アジ化ナトリウムを緩衝液または洗浄液に添加しないでください。

7.PBSでウェルを2回洗浄する。

8. 50μLの抗原溶液をウェルに加える(抗原溶液を滴定すべきである)。すべての希釈は、ブロッキングバッファー(3%BSA/PBS)の中で行う必要がある。室温で湿度の高い環境で少なくとも2時間インキュベートする。

9. プレートをPBSで4回洗浄する。

10.標識された二次抗体を加える。添加する量は、予備実験で決定することができる。正確な定量には、二次抗体を過剰に使用する必要がある。すべての希釈はブロッキングバッファーの中で行う必要がある。

11.湿度の高い環境で、室温で2時間以上インキュベートする。

12.プレートをPBSで数回洗浄する。

13.メーカーの説明に従って基質を添加する。お勧めのインキュベーション時間が経過した後、ELISAプレートリーダーで標的波長における光学密度を測定することができる。
注意:発がん性の可能性があるため、酵素基質の中には有害であると考えられているものがあるので、注意して取り扱ってください。適切な情報については、製品安全データシートをご参照してください。