間接ELISAプロトコール

緩衝液の準備

1. 重炭酸塩/炭酸塩コーティング緩衝液(100 mM)
抗原または抗体は、ウェルに固定化するためにコーティングバッファーで希釈する必要がある。
3.03 g Na2CO3
6.0 g NaHCO3
1000 ml蒸留水
pH 9.6

2. PBS:
1.16 g Na2HPO4
0.1 g KCl
0.1 g K3PO4
4.0 g NaCl (500 ml 蒸留水)
pH 7.4

3.ブロッキング溶液:
一般に使用されるブロッキング剤は、1%BSA含有PBS、血清、脱脂粉乳、カゼイン、ゼラチンである。 

4.洗浄液:
通常は0.05%(v / v)Tween20(TBST)などの界面活性剤を含むPBSまたはトリス緩衝生理食塩水(pH 7.4)。

5. 抗体希釈緩衝液:
一次および二次抗体は、非特異的結合を減少させるために、1×ブロッキング溶液で希釈する必要がある。

間接ELISA プロトコール

1. PBSまたは重炭酸塩/炭酸塩コーティング緩衝液を用いて抗原を1〜20μg/ mlの最終濃度に希釈する。プレートの上部ウェルに50μlの抗原希釈液をピペッティングすることにより、抗原でPVCマイクロタイタープレートのウェルをコートする。必要に応じてプレートを希釈してください。プレートをシールし、4℃で一晩、または室温で2時間インキュベートする。
2. PBSでプレートを3回洗浄する。
3. 1ウェルあたり200μlのブロッキング緩衝液、5%脱脂粉乳/PBSを添加することにより、コーティングされたウェル中の残りのタンパク質結合部位をブロックする。代わりのブロッキング試薬には、BlockACEまたはBSAが含まれる。
4.プレートを接着性プラスチックで覆い、室温で少なくとも2時間、できれば4℃で一晩インキュベートするほうがいい。
5. PBSでプレートを3回洗浄する。
6.各ウェルに希釈された100μlの一次抗体を添加する。
7. プレートを接着性プラスチックで覆い、室温で2時間インキュベートする。
8. PBSでプレートを4回洗浄する。
9.使用直前にブロッキングバッファー中で最適濃度(メーカーにより)で希釈された100μlの結合二次抗体を添加する。
10.プレートを接着性プラスチックで覆い、室温で1〜2時間インキュベートする。
11. PBSでプレートを5回洗浄する。
12.ウェルあたり100μl(または50μl)の基質溶液をマルチチャンネルピペットまたはマルチピペットで分注する。
13. 十分な発色の後(必要な場合)、50〜100μlの停止液をウェルに添加する。
14. 反応を停止してから30分以内に、プレートリーダー上で450 nmでの吸光度を記録する。