免疫沈降/IP-非特異的結合

問題と解決案

A.抗体へのタンパク質の非特異的結合

非特異的に結合するタンパク質が多すぎる場合は、ビーズにロードされたサンプルの量を減らしてください。免疫沈降を開始する前に、調製したライセートとビーズをプレインキュベートすることによってライセートをあらかじめクリアすることもできます。これは、ビーズに非特異的に結合するすべてのタンパク質の溶解物を除去するはずです。研究者はまた、同じ種の無関係の抗体および同じIgサブクラスを使用して、ライセートをあらかじめクリアします。

B.使用される抗体には、十分に特異的ではない抗体が含まれます。

できれば予め吸着された抗原親和性精製抗体を使用してください。

C.非特異的タンパク質はビーズに結合しています。

BSAではビーズを十分にあらかじめブロックすることはできません。BSAが新鮮であることを確認し、1%BSA が含まれるPBSTで新鮮なビーズを1時間インキュベートします。 PBSで3〜4回洗浄してから使用してください。

D.私の免疫沈降実験で非特異的結合があります。

より厳しい洗浄バッファーで洗浄してください。
洗浄バッファーに非イオン性界面活性剤(Tween-20またはTriton X-100)を0.01-0.1%の濃度で加えてください。
沈殿前にビーズがブロックされている場合は、洗浄バッファーに同じブロッカーを加えてください。
洗浄回数を増やしてください。
洗浄時間を延ばしてください。
インキュベーション時間を短くしてください(ビーズとサンプル)。
間接法を試してください。
免疫沈降抗体の濃度を下げてください。
プロテインA /プロテインG /プロテインLまたはビーズ自体に非特異的に結合する分子を除去するためには、あらかじめクリアする工程が必要です。