フローサイトメトリー (FCM) /FACS | フローサイトメトリーとは

フローサイトメトリーは、生理食塩水中の個々の細胞を感知するためのシステムであり、この細い流れに集光されたレーザービームを照射することによって,細胞を1個ずつ高感度,高分解能,高速に測定することができる。

細胞懸濁液がサイトメーターを通過するとき、シース(鞘)液の流れを使用して、流体懸濁液を小さなノズルを通して流体力学的に集中させる。小さい流体の流れは、セルを一度に1つのセルだけレーザー光を通過させる。本質的に、流体工学システムは、サンプルが注入される中心チャネル/コアと、より速く流れる流体を含む外側シースによって囲まれたコアからなる。シース液が移動するにつれて、狭くなる中央チャンバに大量のドラッグ効果が生じる。これは中央の流体の速度を変える。具体的には、流れの正面が放物線状になり、中央での速度が最大で、壁でのゼロになる(図参照)。このエフェクトにより、粒子の単一ファイルが作成され、流体力学的絞り込み(hydrodynamic focusing)と呼ばれる。最適条件(層流)の下では、中央チャンバ内の流体はシース液と混合しない。細胞または粒子から散乱された光は、それらがレーザービームを通過するときに検出される。光線の前方の検出器は前方散乱光(FS)、いくつかの側面の検出器は側方散乱光(SS)を測定する。蛍光検出器は、陽性に染色された細胞または粒子から放出された蛍光を測定する。

光散乱

光散乱

ビームを通過する細胞または粒子に光散乱が生じ、FSとSSとして検出される。このようにして、細胞集団は通常、サイズおよび粒度の差のみに基づいて区別され得る。

左の図:青色レーザーが細胞を調べるときの光散乱。細胞によって散乱される光の方向は細胞の大きさと粒度に相関する。

前方散乱光FSC

側方散乱光SSC

データの取得 & 解析

光が光検出器に当たると、小さな電流(数マイクロアンペア)が発生する。関連する電圧は、検出器によって受け取られる光子の総数に比例する振幅を有する。この電圧は次に一連の線形増幅器もしくは対数増幅器、およびアナログ・デジタルコンバータ(ADC)によって増幅され、図表 でプロットするのに十分な大きさの電気信号(5〜10ボルト)に変換される。

対数増幅は弱い信号を拡大し、強い信号を圧縮するので、通常、蛍光研究に使用され、ヒストグラム上で表示しやすい分布をもたらす。DNA解析のような、あまり広くない範囲の信号の場合、線形スケーリングが好ましい。

各検出器からの測定は「パラメータ」と呼ばれ、例えば 前方散乱光、側方散乱光または蛍光である。各パラメータで得られたデータは「events」として知られており、目的の物理的特徴またはマーカーを表示する細胞の数を指す。

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