フローサイトメトリー (FCM) /FACS | コツ

サンプルの調製

1. 細胞凝集物および断片による装置のブロックを防ぐために、 フローサイトメトリーに使用されるすべてのサンプルが単細胞懸濁液であることを確認する必要がある。
2.単細胞懸濁液の濃度が1×10^6 / mlに達するべきである。濃度が低すぎると結果に悪影響を及ぼす可能性がある。
3.単細胞懸濁液を得るために、異なるサンプルに対して適切に処理することが必要がある。例えば、機械的にばらばらにすることや、酵素的な分解など。
4.personal equationによって生成した細胞を避ける。死細胞の量が20%以上であれば、結果は信頼できない。

蛍光染色

1.蛍光色素で標識した抗体は、暗所で4℃で保存してください。
2.非特異的結合部位をブロックするために、0.5%BSAおよび1%ウシ胎児血清などのブロッキング試薬を使用する必要がある。
3.蛍光色素で染色したサンプルは、安定性を確認するために光を避けて保管する必要がある。
4.非特異的結合部位をブロックし、細胞の活性を維持するために、染色後の細胞の洗浄に使用する緩衝液には、0.5%BSAおよび1%ウシ胎児血清を加える必要がある。
5. 偽陽性および偽陰性を避けるために、適切な洗浄が必要である。
6. 激しい混合は避けるべきである。破損した細胞が多すぎると、非特異的な蛍光が生じる可能性がある。
7.遠心分離の適切な速度は、接着細胞の量を減少させるように設定するべきである。

細胞の自己蛍光を減らす

細胞の自己蛍光は、FADおよびFMN(515nm発光)、NADH(460nm発光)などによって引き起こされる。このような自己蛍光は、低レベルの抗体結合の定量的検出を妨げる。

固定された細胞を、PBS/ 0.1%水素化ホウ素ナトリウム中で30分間洗浄することにより、そのような蛍光を著しく減少させることができる。

氷冷した1μg/ mlトリパンブルー溶液を用いて4℃で10分間インキュベートすることにより、488 nm励起後に自己蛍光を減少させることができる(FITC標識プローブを使用)。

適切な標識物によって、シグナル対ノイズ比を改善する

ノイズは基本的にネガティブコントロールサンプルで見られるシグナルである(一次抗体などはない)。いずれのフルオロフォア標識物も、高レベルで発現する抗原に適用できる。しかしながら、発現レベルが低い場合、フルオロフォアを切り替えることにより、より良いシグナル対ノイズ比を達成することができる。

FACS Calibur 機器を例にして、PE > APC > PerCP > FITC.

Vantage(> 150 mW)のような機械では、PerCPは高いレーザー出力では使用できないことに注意してください。

非特異的二次抗体染色を減少させる

抗体凝集物は、非特異的染色を増加させる。適切な取り扱いと保管をしてください。 4℃で10分間高速遠心分離(IgMまたはPE標識抗体用ではない - 重い)することによって凝集物を除去することができる。

血清、または精製された未標識の、同じ種のIgG(例えば、ヤギ二次抗体を使用する場合はヤギ血清)と細胞をプレインキュベートすること(二次抗体インキュベーションの前に)によって非特異的結合を減少させることができる。通常、10^6個の細胞あたり10μgのIgGで10分間インキュベーションすれば十分である。

抗Fc受容体抗体はまた、フルオロフォア標識一次抗体の非特異的結合を遮断するために使用することができる。上記のように、10^6個の細胞当たり0.5μg。

死細胞は抗体に非特異的に結合する。従って、採取直後に細胞を使用すること、4℃に保管すること、すべての緩衝液にBSAまたは熱不活性化血清が含まれるように注意すること、染色された細胞をすぐに解析することなどで細胞死を最小限に抑える必要が有る。

死細胞は、ヨウ化プロピジウムのような染色液を用いてゲーティングすることによって解析から除外することができる。(FL3チャネル。たとえあなたが、例えば、フルオロフォアを用いて抗原検出にFL2を使用しているとしても、FL2にオーバーフローするが、補正は必要ではない)