フローサイトメトリー (FCM) /FACS | 特異性と非特異性

細胞上の特定のタンパク質に関する結論を引き出すために、使用する色素が目的のタンパク質と特異的に結合できることを確認する必要が有る。次の要因は特異性の欠如を引き起こすことができる。第一に、抗体は、いくつかの異なるタンパク質上の共通エピトープに結合し得る。第二に、異なる種類の細胞には同じタンパク質が含まれているため、染色反応は、異なる細胞の種類を分類する場合と同じくらい特異的ではない可能性がある。この2つの問題を解決するには、特定の質問に答えるための適切な試薬の知識が必要である。特異性に関する他の2つの問題は、もっと制御しにくいである。抗体は非特異的(Fc) 領域によって多くの種類の細胞に結合する。単球は、特に、それらのFc受容体を介して多くの抗体に専門的に結合する。この問題を緩和するには、FabまたはF(ab')2断片(Fc末端を持たない抗体)の使用が薦められる。Fc受容体をブロックすること(下記参照)も役立つ。最後に、膜の完全性が損なわれた死細胞は粘着性があり、あらゆる種類の試薬を憚らなく結合する傾向がある。死細胞の問題は、注意深い細胞調製や、死細胞を解析からゲーティングアウトすることによって解決できる。例えば、ヨウ化プロピジウム染色により、その膜透過性によって死細胞を明らかに識別するか、または、低いFSC強度を有する細胞を避けることによって解決する(それらの細胞質の屈折率は周囲の培地の屈折率と類似しているためか、死細胞は通常、低いFSCシグナルを示す)。しかしながら、最後の分析で荧光染色から細胞分類と化学成分に関する結論を出すには、フロー実験は慎重なコントロールを使用すべきである。