フローサイトメトリー (FCM) /FACS | 二次抗体

抗体染色

直接抗体染色は、一段階染色として標識一次抗体を利用する。多重標的染色にとってより便利である。

フローサイトメトリーの間接的な抗体染色は、検出抗体として二次抗体が必要とする間接免疫アッセイの一種である。二次抗体は、使用している一次抗体に対する「抗抗体」である。たとえば、一次抗体がマウスモノクローナルである場合は、抗マウス二次抗体が必要である。二次抗体は様々な蛍光色素または色素原で標識される。

間接イムノアッセイのメリット:

高感度:一つの抗原分子あたり2つ以上の標識抗体が結合している。 シグナル強度は単一のエピトープ上で増幅することができる。
可動性:異なる一次抗体は、単一標識二次抗体と共に使用することができる。フローサイトメトリーに適した一次抗体のリザーバーは蛍光色素標識の制限なしに広げられる。
コスト節約:必要とする標識抗体はもっと少ない。

間接イムノアッセイのデメリット:

複雑さ:多重染色実験では、適切な二次抗体の選択は複雑で時間がかかる可能性がある。
種間交叉反応性:二次抗体は、標的以外の種と交差反応し得る。吸着処理済みの二次抗体を使用することで、交差反応性を防止することができる。
バックグラウンド:内因性免疫グロブリンを有する試料は、間接的方法で高いバックグラウンドを示すことがある。

二次抗体の選び方:

ホスト種 抗体のクラス/サブクラス ヒト免疫グロブリンアイソタイプ
二次抗体は一次抗体を生成する宿主種に対して作成する。例えば、マウスで作成された一次抗体を使用している場合は、マウス以外の宿主動物種で作成された抗マウス二次抗体が必要である(例えば、ヤギ抗マウス二次抗体)。

二次抗体は一次抗体のアイソタイプに直接対するものである必要が有る。

ポリクローナル一次抗体は一般に、ウサギ、ヤギ、ヒツジまたはロバで作成され、一般にIgGアイソタイプである。 したがって、二次抗体は、典型的には、抗IgG H&L(重鎖および軽鎖)抗体である。

モノクローナル一次抗体は一般に、マウス、ウサギおよびラットで作成される。例えば、一次モノクローナル抗体がマウスIgG1である場合、抗マウスIgGが必要である。

クラス またはアイソタイプ: IgG (γ重鎖), IgM (μ), IgA (α), IgE (ε), IgD (δ)

サブクラス: IgG1 (γ1 重鎖), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4); IgA1 (α1), IgA2 (α2)

タイプ: κ軽鎖, λ軽鎖

サブタイプ: λ1, λ2, λ3, λ4