フローサイトメトリー (FCM) /FACS | バックグラウンド制御に関するアドバイス

機器由来のバックグラウンドシグナル(一般的にノイズと呼ばれる)を無視すると、バックグラウンド蛍光の原因は、(I)自己蛍光、(II)スペクトル重複、(III)望ましくない抗体結合の3つのグループに分類することができる。 これらのグループのそれぞれのバックグラウンドのレベルは、測定のいくつかの要素(例えば、目的の抗原、抗体の選択、蛍光色素の選択、細胞標識プロトコール、およびフローサイトメーターの光学的構成)に依存し、そしてこれらの要素によって最小化することが可能である。 各要素がバックグラウンドレベルに寄与する方法を完全に理解することにより、フローサイトメトリーデータセット中のネガティブおよび他の検出シグナル(すなわち「イベント」)から本当の陽性を見分けるようにコントロールサンプルのセットを設計することができる。

用語 説明
抗原 抗体の産生を誘導する物質。
自己蛍光 自己蛍光; オブジェクトの固有の蛍光。
バックグラウンド 測定すべき現象と混同する可能性のある余分な信号。
Bleed-through (発光) 溢流; 別のスペクトルのピーク強度と重なる発光スペクトルの一部。
交差反応性 生産された抗体が,その抗体産生反応を引き起こした抗原 以外のある抗原に結合すること。
エピトープ 抗体は病原微生物や高分子物質などと結合する際、その全体を認識するわけではなく、抗原の比較的小さな一部分のみを認識して結合する。 この抗体結合部分を抗原のエピトープと呼ぶ。
イベント フローサイトメーターによって処理され、データセット(リストモードファイル)に追加された(光由来の)電子信号。
FMOコントロール Fluorescence-minus-one; 1つを除いて、実験に関与するすべての抗体を含むコントロール。
内部ネガティブコントロール 細胞の集団も含むサンプル中の目的の抗原を発現しない細胞の集団。
Isoclonic control(アイソクロニックコントロール) 蛍光色素標識抗体と、過剰の同一であるが未標識の抗体の混合物。
アイソタイプコントロール アイソタイプコントロールは特定の内在性抗原とは反応しない抗体で、フローサイトメトリーや免疫組織染色で得られた結果を正しく評価するための、ネガティブ・コントロールとして使用する。
陰性細胞 測定技術の検出限界以下で抗原レベルを発現する細胞。
非特異的抗体結合 それに対して産生されたものではないものへの抗体の結合。
相対蛍光強度 フローサイトメーターの機器設定に対する蛍光の量。
分解能指標 陽性および陰性集団間の分離度であり、以下のように記述される。
特異的抗体結合 それに対して産生されたエピトープへの抗体の結合。
スペクトル蛍光補正 bleed-through発光を補正するための数学的方法。
スペクトルオーバーラップ 2つ(またはそれ以上)の蛍光発光スペクトルの間の溢流。
Spreading error 不正確な測定およびスペクトル補正による誤差。
染色指標 陽性集団が陰性集団からどれくらい離れているかを次のように説明する。
望ましくない抗体結合 ユーザーによって定義された用語ですが、一般的には、抗体と細胞との間の任意のタイプの結合はデータの正しい解釈をあいまいにする。

非特異的結合:

悪化要因と可能な解決案:

抗体量:過剰 な抗体は、非特異的結合を増加させ、陽性細胞の分離を減少させ、シグナル:ノイズ比を低下させることができる。

Þ可能な解決案:抗体を滴定する。 出発点として、同じ蛍光色素標識を有する抗体は通常同様の濃度で使用することができる。

細胞外マトリックス/細胞含有量:すべての細胞は、様々な相互作用を介してある程度抗体を含むタンパク質に結合する。

Þ可能な解決案:洗浄液および染色溶液へのタンパク質の添加は、これらの結合部位の多くをカバーする。 ほとんどの染色プロトコルには、この目的のためにBSAまたは血清(ヒトまたはFCS)が含まれる。

死細胞:死細胞は、非特異的に抗体に結合することで有名であり、しかも非常に粘着性がある。これは部分的にはDNAに起因するが、DNAseを含むことは部分的にしか問題を解決できない。

Þ 可能な解決案: 可能であれば、すべての染色に生/死細胞の鑑別を含めるべきである。死細胞は、特に固定後、FSC / SSCの特徴だけで完全に分離することはできない。しかし、PIまたは7AADで染色した細胞を固定することはすべての細胞を部分的に透過処理することに注意してください。すると、PIまたは7AADは、標識された細胞から他の細胞に漏出することができ、最終的にすべての細胞を均一に染色する。7AADの場合、これは非蛍光アクチノマイシンD(Schmidら)を含めることによって回避することができる。しかし、今日では、複数の生/死細胞鑑別試薬が利用可能であり、それにより潜在的な漏出を阻止し、この問題を完全に回避することが可能である。

抗体とFc受容体との結合:

明らかに、Fc受容体(FcR)は高い特異性で抗体に結合するが、これは単に種特異的であるというのがよくある誤解である。しかしながら、1つの種からのFcRは、他の種からの抗体に様々な程度で容易に結合する。

可能な解決案:

(a) FabまたはF(ab)2フラグメント:Fc末端を持たない抗体を使用すると、この問題は完全に回避できるが、ほとんどの市販の抗体はFc部分を含む。

(b) 'Fc-Block':特定のFcRに特異的な抗体を加えることによって、あなたの実験抗体との望ましくない相互作用をブロックする。しかし、マウスに一般的に使用される「Fcブロック」は、マウスFcγ-RII(CD16)およびFcγ-RIII(CD32)に特異的なブロッキングモノクローナル抗体2.4G2(ラットIgG2b kappa)である。したがって、他のFcRは2.4G2によって直接ブロックされない。しかしながら、市販抗体の大部分はIgGサブタイプであり、潜在的な非特異的Fc結合の大部分は2.4G2によってブロックされる。ヒト細胞染色に用いる似ている製品は広く入手可能である。

(c)未標識抗体:実験的抗体と同じ種およびアイソタイプの未標識抗体を染色されたカクテルに添加すると、ほとんどの潜在的なFcR結合部位が飽和する。

彼らが概説したように、確かな副作用として、2.4G2または他のアイソタイプのいずれかの未標識抗体を染色液に添加すると、偶発的に他の潜在的な非特異的結合のほとんどが飽和状態になる。したがって、未標識抗体を表面および細胞内染色カクテルに添加すると、非特異的結合が減少する。

蛍光色素とFc受容体の結合

Fc受容体(FcR)が抗体に結合するという事実は明白であるが、あなたの抗体に結合した蛍光色素の一部も一部のFcRに結合できるという事実はあまり知られていない。

R-phycoerythrin (PE)はマウスFc-gamma-RII (CD16) とFc-gamma-RIII (CD32)に結合できることはすでに報告されている(Takizawaら)。さらに、蛍光色素のFcR結合は、明らかに、単独またはタンデム標識(Shapiro)のいずれかで、シアニン蛍光色素の大部分または多分すべてに適用する。現在まで、Cy5 (Jahrsdorfer et al.)、PE-Cy5 (van Vugt et al.; Steward and Steward; Jahrsdorfer et al.) および APC-Cy7 (Beavis et al.)のレポートを見出した。この場合、ヒトCD64(Fc-γ-RI)はいくつかの結合の原因であることが示された(van Vugtら、Jahrsdorferら)。しかし、CD64neg白血病細胞にも結合することが報告されており(Steward and Steward)、従ってFcRの役割はまだ全ての症例を解決していない。

Þ 可能な解決案:

(a) PE: マウスCD16 / 32へのPEの結合に関して、「Fc-ブロック」を使用してください。すなわちブロッキングモノクローナル抗体2.4G2(ラットIgG2b kappa)を添加することはこの問題を回避することが可能である(Takizawaら)。

(b) シアニン: FcR +細胞、特に単球を用いて作業する場合、目的の細胞を染色するには、シアニン含有蛍光色素を避けることを考えてください。

蛍光色素と抗原受容体の結合

Phycoerythrin(PE)およびallophycocyanin(APC)は、それぞれラン藻または紅藻から由来する240kDおよび110kDの大きなタンパク質である。これらのフィコビリンタンパク質はまた、いくつかのT細胞およびB細胞の特異的抗原であることが判明している。全てのマウスB細胞の約0.1%がPEを抗原としてBCR依存的に認識する(Papeら、Wuら)。同様に、全てのマウスB細胞の約0.02%がAPC抗原特異的である(Papeら)。さらに、全てのgamma-delta-T細胞(マウスおよびヒト)の約0.02-0.4%がPEを特異抗原として認識する(Zengら)。

Þ可能な解決案: これらの細胞の頻度が低いことを考えると、B細胞やgamma-delta-T細胞の小さなサブセットを研究すると、これらの細胞は問題を引き起こすだけである。その場合は、関心のある細胞にPEを使用しないでください。

蛍光色素と他の受容体または相互作用パートナーとの結合

(a)抗体の交差反応性:エピトープは異なるタンパク質間で共有される可能性がある。つまり、抗体は問題のタンパク質を認識するだけでなく、別のタンパク質の似ているエピトープも認識する。ポリクローナル抗体の場合、この可能性はもっと高い。

Þ 可能な解決案: モノクローナル抗体の使用により、そのような交差反応性のリスクを低減することが可能。あなたの抗体の交差反応性を疑う場合、同じエピトープに対する異なるクローンを使用することで、この問題を解決するかもしれない。

(b) 細胞内ビオチン:ビオチンは、細胞代謝の重要な要素である。したがって、ビオチンは細胞内に存在し、ストレプトアビジンを細胞内染色に用いる場合、ストレプトアビジンの細胞ビオチンへの結合をもたらす。

Þ可能な解決案:細胞内染色にビオチン標識抗体を使用する必要がある場合は、ビオチン標識抗体を添加する前に、未標識ストレプトアビジンとともに細胞をインキュベーションする(それから、徹底的に洗浄する)ことによってすべての細胞内ビオチンをカバーすることができる。

(c) FITC 荷電:FITCは荷電分子であり、多くのFITC分子(すなわち、高いF/P比)を有する抗体は高荷電抗体をもたらす。それはおそらくは静電的相互作用を介して細胞質エレメントに非特異的に結合する(Hulspasら)。これは主に、細胞内染色の問題であり、表面染色の問題ではないようである。

Þ 可能な解決案:このため、FITCは細胞内染色には理想的ではなく、異なる蛍光色素で、あなたの抗体を標識することを試してみてください。

(d) CD205: CD205(DEC205)は樹状細胞上で高度に発現するC型レクチンである。最近、PE-Cy5.5がマウスCD205に高い特異性で結合することが実証されている(Parkら)。ヒトCD205の染色は観察されなかった。また、マウスCD205への他のCy5.5標識物(PerCP-Cy5.5、APC-Cy5.5およびCy5.5)の結合は、PE-Cy5.5(Parkら)よりかなり弱かった。

Þ可能な解決案:相互作用の特異性が高いことを考えると、目的の細胞がマウスCD205を発現する場合、PE-Cy5.5の使用を避けるべきであり、そしてより少ない程度で蛍光色素を含む他のCy5.5も避けるべきである。

その他の効果

最後に、別のodd-ballがAPCタンデムに用いることが報告された。どうやら、生細胞には代謝に依存してAPC-Cy7とAPC-H7タンデムを分解し、APCシグナルを残す方法がある(Le Royら)。APC-Cy7はAPC-H7より影響を受けているようであり、単球はリンパ球よりもこのシグナルを分解する際により活性が高い。

Þ 可能な解決案: これが生細胞を必要とすることを考えると、染色後の細胞溶液の固定はこの問題を解決する。また、この分解は代謝的に活性な細胞を必要とするため、細胞溶液を4°Cまたは氷上に保存するか、またはアジ化ナトリウム(NaN3)を保存バッファーに添加することで効果を減少させることができる。

参考文献:

Ruud Hulspas,et.al., Considerations for the Control of Background Fluorescence in Clinical Flow Cytometry, Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 76B:355–364 (2009)

Gerhard Wingender, Artifacts and non-specific staining in flow cytometry, 2013