フローサイトメトリー (FCM) /FACS | 試薬と例

試薬

染色バッファー

ろ過滅菌した0.1% BSA含有1× PBS。使用するまで氷上に放置するか、4℃で保存する。細胞を染色するために無菌状態に保たれる限り、一度に1Lを調製して4℃で保存することができる。

10× PBS: (室温で保存する)

1) Sodium Phosphate, monobasic, monohydrate
NaH2PO4-H2O (FW 137.99)         2.56 g

2) Sodium Phosphate, dibasic, heptahydrate
Na2HPO4-H2O (FW 268.07)         22.49 g

または

Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous
Na2HPO4 (FW 141.96)              11.94 g

3) Sodium Chloride
NaCl (FW 58.44)                87.66 g

dH2O中に1Lまで加え、必要に応じてろ過滅菌する。


ソーティングバッファー

基本バッファ:
1× Phosphate Buffer SalineまたはHanks Buffer (Ca/Mg2+ free) 
1 mM EDTA 
25 mM HEPES pH 7.0 
0.5-2%のウシ胎児血清(熱不活性化) または1% BSA 
0.2 μm ろ過滅菌
4°Cで保存する。

清潔なリンパ球細胞の場合:バッファーを1%FBS含有HBSSに簡略化することができます。レシピのその他のカチオンはより良い生存率を促進します。これらの細胞は凝集しにくいので、EDTAの欠如は問題ではない。

粘着性の細胞の場合:EDTAの濃度を5 mMに上げ、Ca/Mg2+ free PBSに対して透析したFBSを使用する。いくつかの活性化細胞は塊状になり、キレート剤(EDTA)はカチオン依存性細胞間接着を減少させるのに役立つ。

接着細胞の場合:良好な単細胞調製を達成するためには、プレートから細胞を剥離 する瞬間から始める必要がある。通常、培地またはPBS / FBS緩衝液でトリプシン(または他の剥離緩衝液)を消光する。これは、細胞がプレート(または互い)に再付着するのを容易にするカチオンを再導入するので、問題になる。剥離を止めるには、カチオンフリーFBS緩衝液を使用しなければならない。さらに、必要に応じてEDTAのレベルを上昇させることができる(しかし、EDTAが多すぎると有害である可能性がある)。

死細胞の割合が高いサンプルの場合:プレップに多数の死細胞がある場合、溶液から出る死細胞からの可溶性DNAが存在する可能性がある。このDNAは細胞をコーティングし始め、重度の凝集塊を引き起こす。緩衝液レシピに10 U / ml のDNase IIを添加すると、DNA関連の塊状物を減少させるのに役立つ。

これらの提案は、生存率と回復の向上について、サンプル調製を最適化するのに役立つはずである。 これらの単純なガイドラインから発展するより包括的な修正が必要であるかもしれない。

注意:
選別すべき細胞の終濃度: 1 x 10^7/ml (高または中圧の場合) 5 x 10^6/ml (低圧の場合)   
インキュベーターの境界の外側でpHが塩基性になる傾向があり、これは生存率および回復率が低い原因である可能性がある。したがって、培養培地はソートバッファーとしてはあまり適していない。HEPESの添加は、pHを安定させるのに役立つ。
粘着性ではない細胞については、ソートバッファを変更してEDTAを省略することができる。細胞は幸せを保つ必要があり、最低量のFBSを使用すべきである。
EDTAの添加は、一部の細胞タイプの粘着性を軽減するのに役立つ。EDTAの濃度は5mMを超えてはならない。

塩化アンモニウム溶解バッファー

1. 1リットルの蒸留水に8.29gのNH4Cl、1gのKHCO3、および37mgのNa2EDTAを溶解する。
2. pHを7.2に調整する。
3.毎回新しい溶解バッファーを調製し、使用前に0.22μmのメンブレンフィルターを通過させる。

透過処理バッファー

0.5% BSA
1 × PBS
0.5%サポニン

細胞周期のフローサイトメトリー解析(PI染色プロトコル)

用途と原理
ヨウ化プロピジウム、7-AADおよびToPro-3はすべて、二重らせん上の特定の点でDNAに結合する。 結合した色素の量はDNAの量に比例する。このように、蛍光の量はDNAの量に比例する。これがフローサイトメトリーでこれらの色素を使用する理由であり、即ち、細胞のDNA量(細胞周期)を評価することである。

材料:

ヨウ化プロピジウム (sigma):水中で10 mg/ml、4℃で保存する。
注意: RTで作成された溶液は、冷蔵庫の中で溶液から出てくる。大丈夫。それを混ぜ合わせ、クライドを染色混合物に浴びせかけてください。
RNaseA (Sigma)、水中で10 mg/ml、4℃で保存する(長期間20℃)
PBS: 4°Cで
エタノール (100%、-20°Cで保存)

固定:

1) 培地から細胞を1500rpm×5分で回転させる。
2) PBSで1回洗浄する。
3) 2×10^6個の細胞を集める。
4)細胞を1,500rpm、4℃で5分間回転させることによって、沈殿させる。
5) 300 ulの冷PBSに細胞ペレットを再懸濁する。ボルテックスする。
6) -20℃の無水エタノール700μlを添加して細胞を固定する(最初に滴下する)
7)解析の準備ができるまで、この固定バッファーに-20℃で細胞を保存する。(2週間以内)

染色:

1)固定した細胞を遠心分離し(上記のように)、1mlのPBSにペレットを再懸濁する。
2)100μlの200μg/mlのDNase-free RNaseAを添加し、37℃で30分間インキュベートする。
3)100μlの1mg / mlのヨウ化プロピジウム(光感受性)を添加し、室温で5〜10分間インキュベートする。
4)サンプルを12×75 Falconチューブに放置し、Becton Dickinson FACSCaliburで読み取る。

フローサイトメトリー :
Analyze on linear with FL2-W versus FL2-A for doublet discrimination, be sure to compensate out of FL3.

重要なテクニカルノート:

開始前の一般的な注意事項:MeOHを添加する前に細胞外のマーカーに用いる細胞を染色してください...細胞にGRP / RFP / YFPや他の蛍光タンパク質がある場合は、具体的な指示を聞いてください...いけないわけではないが、このプロトコールではない。MeOHで固定すると、蛍光タンパク質は細胞から漏出する。

参考文献 : Experimental Cell Research 207,142-151.

Hoechst 33342 HSC 染色および幹細胞精製プロトコル

(See Goodell, M., et al. (1996) J Exp Med 183, 1797-806)

Hoechstの精製は正常なC57Bl/6骨髄(NBM)上に確立され、マウス造血幹細胞(HSC)に用いる。ご実験室で手順を確立し、フローサイトメーター上のside population (SP)を確実に同定するために、この骨髄を用いて最初の実験を実施することを提案する。

C57Bl/6骨髄のHoechst染色

Hoechst SP細胞を識別する能力は、多剤様トランスポーターによるHoechst 33342の異なる流出に基づくことに注意してください。これは活発な生物学的プロセスである。したがって、染色条件に大きな注意を払った場合、プロファイルの最適な解像度が得られる。 Hoechstの濃度、染色時間、および染色温度はすべて重要である。 同様に、染色プロセスが終了したら、さらなる色素流出を禁止するために、細胞を4℃に維持しなければならない。次のプロトコルに厳密に従えば、SP細胞を簡単に見出すことができる。

1)水浴の温度が正確に37°Cであることを確認する(温度計でこれをチェックしてください)。骨髄を調製する時DMEM+(下記参照)を予熱する。
2)5-8週齢のマウスを用いて、大腿骨および脛骨から骨髄を調製し、HBSS+に再懸濁する(下記参照)。
3)有核細胞を正確に数える。C57Bl/6マウスあたり平均5×10^7個の有核細胞を見出す。この数は株ごとに異なる。
4)骨髄を遠心分離する。予熱したDMEM+中で1mlあたり10^6個の細胞で再懸濁する。よく混ぜる。
5)終濃度が5μg/mlになるまで、Hoechstを加える(a 200× dilution of the stock)。
6)細胞をよく混合し、37℃の水浴に90分間完全に入れる。細胞の温度が37℃に維持されるように、染色チューブが水に完全に浸されていることを確認してください。 インキュベーション中にチューブを数回混合する必要がある。Corning 250 mlポリプロピレン遠心管で大量の骨髄を染色するのが最も便利であることを発見した。染色が温度に対する感受性のため、頻繁に使用されるため温度が常に変動する水浴を使用しないでください。あなたの友人が500mlの氷冷培地ボトル、または500mlの凍結血清を入れる場合、あなたの組織培養フードの隣にある水浴は絶えず温度を下げている。
7) 90分間後、COLD中で細胞を遠心分離する。COLD HBSS+中で再懸濁する。
8) この時点で、サンプルはFACS上で直接実行するか、または抗体*でさらに染色することができる。Hoechst色素が細胞から漏出することを防ぐために、すべてのさらなる操作は4℃で行わなければならない。すべての手順が4℃で行われる場合、この段階で磁性濃縮を使用することもできる。あるいは、Hoechst染色の前に磁気濃縮を行う。
9) 染色の終わりに、死細胞識別のために2μg/ mlのヨウ化プロピジウム(PI)含有冷HBSS +中で骨髄細胞を再懸濁する。これはSP細胞を見ることに必要ではないが、多少役立つ。Hoechstは骨髄にいくらか毒性があり、PIは死細胞をプロファイルから除外することができる。

* Hoechst染色細胞の抗体染色

正しい集団を持っていることを確認するために、Hoechstで染色された骨髄を抗体で同時染色したいかもしれない。マウスSP集団が細胞表面マーカーに関して非常に均質であることを見出した。ほとんどのSP細胞(Sca-1またはc-kit)を陽性に染色する抗体と、SP細胞を染色しないが骨髄の大部分(例えばGr-1またはB220)を染色する抗体という2種類の抗体で染色することをお勧めする。 これらの抗体はPharmingenから入手可能である。Sca-1-FITCおよびGr-1-PEを推奨する。図2は、これらのマーカーを有する全骨髄およびSP細胞の典型的な染色を示している。

Hoechst 33342 
Sigma(Bis-Benzimideと呼ばれる)から粉末を入手し、水中に1mg / mlで再懸濁し、ろ過滅菌し、小さいアリコートで凍結する。 Hoechstは高価ではないので、古い染料や凍結した染料を再利用する理由はない。

HBSS+ 
Hanks Balanced Salt Solution (Gibcoから) と2%のウシ胎児血清、および10 mM HEPES buffer (Gibco).

DMEM+ 
DMEM (Gibco) と2%のウシ胎児血清、および10mM HEPES buffer (Gibco).

ヨウ化プロピジウム
Sigmaから獲得する。凍結ストックは水中10mg / mlである。 作業ストック(アルミ箔で覆われ、冷蔵庫に保管されている)はPBS中200mg / mlである。 サンプル中のPIの最終濃度は2 mg / mlでなければならない。

その他の種
複数の種の最適なHoechst染色プロトコールは似ている。マウスSP細胞には90分、ヒト、アカゲザルおよびブタ細胞には120分が最適であることがわかった。上記のプロトコールに正確に従ってください。しかし骨髄には120分間染色する。
細胞の保存 
骨髄の調製と選別が同じ日に行うことができない場合は、BMをHoechst染色の前に一晩冷蔵庫に保管することを推奨する。 私たちの経験では、フィコール処理してない骨髄を4℃に保管するときの細胞生存率は最も高い。 [マウス骨髄はフィコール処理する必要がないことに注意してください] 朝には、フィコール処理した、またはフィコール処理してない骨髄をを37℃に温め、10^6細胞/ mlで再懸濁し、上記のようにHoechstで染色する。骨髄を組織培養プラスチックに蒔き、一晩インキュベーターに放置することはお勧めしない。


フローサイトメトリー

設定

BD(Facstar-plusおよびVantage)およびCytomation(MoFlow)の複数のサイトメーターでこの設定を使用した。Hoechst染料とヨウ化プロピジウムを励起するためには、紫外線レーザーが必要である。その他の蛍光色素を励起するために、もう一つのレーザーが必要である(例えば、FITCおよびフィコエリトリンを488レーザーで励起する)。 Hoechst色素を350nmのUVレーザーで励起し、その蛍光を450/20 BPフィルター(Hoechst Blue)および675 EFLP光学フィルター(Hoechst Red)(Omega Optical、Brattleboro VT)で測定する。 610nmのDMSPを用いて発光波長を分解する。ヨウ化プロピジウム(PI)蛍光は、675 EFLP(350nmで励起されている)を通して測定する。PIはHoechstの赤信号よりもはるかに明るいことに注意してください。 Hoechst blueは、Hoechst 33342 DNA量解析のための標準解析波長である。私たちは他のフィルターセット/組み合わせを試みた。他のものは十分に働いているが、これが最良の結果をもたらすことを発見した。Hoechst染色を行う細胞をフローサイトメーター上に置き、好ましくは冷却装置を使用して冷却を保つ。前方散乱パラメータと側方散乱パラメータにライブゲートを確立する必要はない。まず、Hoechst BLUE vs. REDプロファイルを表示し、縦軸にBLUE(450 BPフィルタ)、横軸にRED(675 LP)が表示される。検出器がLINEARモードの場合、赤血球が左下隅に、死細胞が右端の垂直線上に並ぶように電圧を調整する(PI波長に対して非常に明るいので死細胞:図1参照)。残りの細胞の大部分は中央に位置することができる。右上へ移動するS-G2M細胞を有する主要なG0-G1集団を同定することが可能である。

図1に示されるようなプロファイルが表示されたら、ライブゲートを描いて赤血球と死細胞を除外する。 次に、このウィンドウ内に大きなファイルを収集する。 明確にSP領域を識別するためには、このライブゲート内に50,000-100,000のイベントを収集しなければならない。 SP領域は、図に表示される。 罹患率は低く、マウスの全骨髄の約0.05%である。 ヒトのサンプルでは、罹患率はもっと低い(フィコール処理された骨髄の0.03%)。ベラパミルで集団をブロックするか、または抗体と同時染色によって、正しい細胞を識別したことを確認することができる。

ベラパミルは50μMで使用され(Sigmaから購入し、95%エタノール中100×ストックを作る)、Hoechst染色手順全体に必要である。マウスSP集団を確認するために、共染色する良好な抗体は、Sca-1およびGr-1または別の系譜抗原である。 図2は、Gr-1およびSca-1で染色した全C57Bl / 6骨髄およびSP細胞を示す。 ヒトSP細胞の場合、ベラパミルでブロックすることもできる。 抗体染色の場合は、CD34とその他のマーカーを使用できる。 ヒトSP細胞の最も一貫した特徴はCD34発現の欠如である。 低いが、可変レベルのCD38を発現する。

複数のHoechst集団の最適分解能に関するほかのコツ

Hoechst色素の解析は線形モードで行われるので、良好なCVが重要であることがわかった。 線形モードで非常に狭い分布を有する粒子(例えば、CoulterのDNA Check bead)を用いてアラインメントを行う。さらに、最適なCVを得るために「first」位置でUVレーザーを使用した(これはDNA(Hoechst blue)の閾値化が可能であるという利点を有するため、赤血球とは無関係である)。 ただし、これは必須ではない。

良好なCVを得るために、サンプル差圧はできるだけ低くする必要が有る。 好ましくは、最大サンプル差圧をアライメント粒子で較正する。 言い換えれば、あなたのアライメント粒子に対するCVが3%で、差圧が低い場合、依然として良好な%CVが得られると同時に、その圧力を超えていない最高の差圧を決定してください。 最後に、UVレーザーの比較的高いパワーが最良のCVを与える。50〜100mWでは最良のHoechst信号が得られることが分かった。 より少ないパワーで十分であるが、集団は明らかに分解されないかもしれない。

Hoechst蛍光についての他のコメント

遠赤色(> 675 nm)でHoechst蛍光を見るのはなぜですかと、多くの人々から聞かれた。これは確かに驚くべきことである。 偉大なフローサイトメトリーの教科書のどれもこれまでのところHoechst蛍光を記録していない。 これはHoechst蛍光の単独の発光ピークを表しているとは考えていないが、Hoechstが細胞を非常に明るく染めるという事実である。シグナルの総量が非常に大きいため、この重要なシグナルを検出することに努めている。 しかし、信号を簡単に検出することはできるが、赤色の波長の信号は青色に比べてあまり明るくない。 私たちの赤いPMTの電圧は、通常かなり高い。

赤いシグナルはヨウ化プロピジウムではないことに注意してください。 PI陽性細胞はこれらのHoechst赤血球よりもさらに明るく、プロファイルの右端に並んでいることがわかる(図1参照)。 もちろん、488レーザーを稼働させている場合は、Hoechstプロファイルに基づいてそれらをゲートアウトするまで、PEおよびPIチャンネルにもPI陽性細胞が表示される。 赤色のHoechst蛍光を見ていることを考えれば、何が起こっているですか? そして、なぜ多くの集団が分解されたのですか? Hoechstは同時に次のことをしている。

1) それはDNA結合色素であり、DNA細胞周期解析に使用することができる。あなたのプロットの右上に達する細胞のいくつかはS-G2Mにある。 また、均一な細胞集団があれば、1つの波長(通常は青色)でHoechst蛍光を見ると、簡単な細胞周期プロファイルが得られるはずである。
2) Hoechstは造血幹細胞によって産出される。 それが、SP集団における低Hoechst蛍光を見る理由である。
3)Hoechstには、クロマチン効果と考えられる理解できない性質もある。 文献検索を行うと、HoechstがAT塩基対にどのように結合するのかに関する多くの情報を見つけられるが、結合および発光スペクトルがクロマチン構造によってどのように影響を受けるかを考えることができる。この二重波長現象を詳細に探究する最高の論文は次の通りである。
Watson, J. V.; Nakeff, A.; Chambers, S. H.; Smith, P. J. (1985) Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry 6 310-5.