フローサイトメトリー (FCM) /FACS プロトコル

試料調製

典型的には、50〜100μlの実験サンプル(試験あたり)において0.5〜1×10^6個の細胞を使用する。 用途が異なるため、最適な結果を得るために各研究者は試薬を滴定する必要がある。
抗体染色の前に血清タンパク質を除去するために細胞をPBSですすいでください。 複数の抗体で染色する場合は、一緒に抗体のプールを調製してください。
すべてのインキュベーションは氷上で最小限の光暴露で行うべきである。

抗体染色プロトコル

組織からの細胞のFcブロック

1. これらの細胞のFc受容体がブロックされない限り、貪食細胞(マクロファージおよび顆粒球など)は抗体に非特異的に結合することができる。サンプルがマクロファージを含む可能性のある組織均質化由来である場合、またはFc受容体を発現する細胞培養株(DaudiおよびTHP-1など)由来である場合、受容体をブロックするために、抗Fc受容体非標識抗体(マウスの抗CD16/32またはヒトのヒトIgG)を使用することができる。Fc受容体がない細胞の試料はFcブロック工程をスキップすることができる。
2. 1 μgのFc ブロック抗体を直接に加えるか、または5 μgのヒトIgGを100μlの懸濁細胞に加える。
3.氷上で20分間インキュベートする。
4. 一次抗体染色(Fcブロック抗体を洗い流す必要はない)に直接進んでください。蛍光一次抗体に適応可能で、二次抗体染色には適応可能ではない。

ヒトPBMCおよび細胞株の細胞表面染色

一次抗体の染色 
1. 1 μgの一次抗体を直接に50-100 μlの懸濁細胞に加える。
2.氷上で20分間インキュベートする。
3. 1 mlのPBSを加えて、非結合抗体をすすぐ。
4. 1200-1500 rpmで5分間遠心分離する。このステップをもう一回繰り返す。デカントし、残留液に細胞を再懸濁する(~100 μl)。あなたの一次抗体が蛍光色素で標識されている場合は、ステップ10に進んでください。

二次抗体の染色
5. 1 μgの標識された適切な二次抗体を直接に50-100 μlのすすいだ細胞に加える。
6. 氷上で20分間インキュベートする。
7. 1 mlのPBSを加えて、非結合抗体をすすぐ。
8. 1200-1500 rpmで5分間遠心分離する。このステップをもう一回繰り返す。
9.遠心分離の後、上清を細胞ペレットからデカントする。残留液に細胞を再懸濁する。

細胞を希釈し、解析する
10. 200-400 μlのPBSを加えて細胞を希釈する。細胞集塊についてサンプルをチェックしてください。機器の目詰まりを防ぐために、塊状の細胞は、フローサイトメトリーの前に70μメッシュフィルター(mesh filter)でろ過する必要がある。サンプルはフロー分析にすぐに使用可能である。

細胞の固定
数時間(通常4〜6時間)以内にフローサイトメーターで細胞を分析できない場合は、細胞を固定する必要がある。

11. 1%パラホルムアルデヒド含有PBSの溶液を調製する。
12.残留液に細胞を再懸濁した後(ステップ4またはステップ9で染色が完了したとき)、250 μlの1%パラホルムアルデヒド溶液を加える。
13.試料は冷蔵庫の中で暗所に保管すべきで、少なくとも数日後に読み取ることができる。
14.分析のためにサンプルを提出する前に、細胞集塊についてチェックしてください。
固定は、GFPなどのいくつかの蛍光タンパク質を消光させることがある。
少なくとも24時間前にフロー解析を予定 するようにしてください。
少なくとも1週間前にフローソーティングを予定 するようにしてください。

細胞内染色

1.特異性を検証し、バックグラウンド染色を排除するために、適切なネガティブコントロールを使用すべきである。象限統計を設定するのを助けるために、同じアイソタイプと濃度の抗体が無関係であることをテストすべきである。
2. 非常に過酷な条件を用いて、または長期間にわたって細胞を固定すると、標的エピトープが変化し、抗体に認識されなくなる可能性がある。一貫した結果を得るために、推奨される固定条件に厳密に注意する必要がある。
3. 0.25 mLの固定/透過処理溶液中で最大0.5〜1×10^6個の洗浄された(または表面染色された)細胞を再懸濁し、氷上で30分間インキュベートする。
4.単細胞懸濁液を維持するために、細胞を断続的にボルテックスする。固定後、1500rpmで5分間遠心分離することによって細胞を1×Perm/Wash bufferで2回洗浄する。
5.上清をデカントし、チューブに約50〜100μLのPerm/Wash bufferが残っていることを確認してください。
6.残っているPerm/Wash bufferに穏やかに細胞を再懸濁し、1 μg(または予め滴定された量)の抗体複合体を添加する。
7.チューブを短時間ボルテックスし、氷上で暗所で30分間インキュベートする。
8.各回1mLのPerm/Wash bufferを用いて細胞を2回洗浄する。ステップ9のように遠心分離する。
9. 200-400 μLのPBSまたは1%パラホルムアルデヒド溶液で各チューブに細胞を再懸濁して、フローサイトメトリーによる解析に用いる。