フローサイトメトリー (FCM) /FACS |サンプルの性質

サンプルの性質

サンプルの性質は、どの抗体が最も適切かを決める。次の点を考慮してください。

1.検出したいタンパク質の分布。 抗体は、免疫原性物質または抗原による宿主動物の免疫化によって生成される。 免疫原は、全長タンパク質、タンパク質断片、ペプチド、whole organism(例えば、細菌)または細胞であり得る。免疫原は一般的にデータシートに記載されている(しかし、免疫原の正確な記述は専有理由のために与えられていない場合もある)。

抗体の生成に使用した免疫原が、検出しようとしているタンパク質の領域と同一であるか、または含まれていることを確認してください。 例えば、FACSによって生細胞上の細胞表面タンパク質を検出しようとする場合、タンパク質の細胞外ドメインに対して産生される抗体を選択する。

2. サンプルの処理。 いくつかの抗体は、サンプルを特定の様式で処理することを必要とする。多くの抗体は、タンパク質の二次および三次折り畳みによってカバーされたエピトープを明らかにするため、還元および変性タンパク質のみを認識する。一方、いくつかの抗体は、それらの天然の折りたたまれた状態のタンパク質上のエピトープのみを認識する。

Sino Biological Inc.のウェスタンブロット抗体は、データシートに別途記載がない限り、サンプルを還元および変性する必要がある。免疫組織化学の場合、いくつかの抗体は固定されていない凍結組織にのみ適切である。他のものは、ホルマリン固定によって導入された架橋を逆転させる抗原賦活化ステップなしに、ホルマリン固定パラフィン包埋組織中でそれらの標的に結合することができない。これらの使用制限はデータシートのアプリケーション部分に記載されている。

細胞質

細胞質は、細胞のハウスキーピング機能の大部分の部位であり、核の指示に従って活動を行う。細胞質の外観は細胞ごとに大きく異なることがあり、したがって、顕微鏡によって異なる種類の細胞を区別する上で重要な役割を果たす。細胞質はまたいくつかの共通の構造を含み、細胞およびその活性に関する有益な情報を提供する。 ここでは主に、フローサイトメトリーで検出可能な構造を説明する。

小胞体は、細胞内で使用するか、または細胞から輸出する分泌産物を輸送する一連の膜結合チャネルである。ゴルジ体では、小胞体の生成物の修飾、保存、輸送経路への導入が行われる。小胞体およびゴルジは一緒に、細胞中の脂質およびタンパク質を適切に選別する。小胞体はまた、シグナル伝達に関連する脂質輸送および種々の輸送に関連するヒト疾患において重要な役割を果たす。フローサイトメトリー実験室では、コレステロール、およびサイトカインとして知られる免疫調節タンパク質の細胞内発現に関連する研究にも使用することができる。

フローサイトメトリーにおいて特に重要であるもう一つの細胞質構造はミトコンドリアである。細胞の体積の10%を占めるミトコンドリアの主要機能は、酸化的リン酸化および脂質酸化によってエネルギーを産生することである。また、アポトーシス、細胞内カルシウムホメオスターシス、および尿素、ヘムおよびステロイドの産生にも関与している。その存在量および形態は、細胞型、生殖段階および活動レベルによって異なる。様々なフローサイトメトリープローブがミトコンドリアの形態および機能をモニターすることが可能であり、代謝性および神経変性疾患、薬物耐性、受精、細胞シグナル伝達および臨床と研究実験室に関連する多数の他のトピックに関する貴重な情報を提供する。

細胞膜

細胞全体は、細胞の化学組成を調節する選択的障壁として働く細胞膜に囲まれている。細胞膜は多くの理由からフローサイトメトリーにおいて特に重要である。まず、細胞膜は細胞の識別子として働くことができる表面タンパク質または抗原を固着させる。これらの抗原は、機能、細胞系譜および発達段階などの細胞に関する特性を規定する。数が非常に多いため、科学界は割り当てられる分化群、すなわちCD番号に基づく分類システムを採用している。例えば、CD4はヘルパーT細胞の表面上のマーカーであり、CD56はナチュラルキラー(NK)細胞の表面上のマーカーである。CD抗原に加えて、細胞表面には無数の受容体分子が存在する。これらの受容体分子は特異的リガンドに結合すると細胞内で複雑なシグナル伝達経路を引き起こすことができる。

フローサイトメーターは、それらに対する蛍光標識モノクローナル抗体を用いて、これらの受容体および抗原の存在および相対数を検出することができる。これらの分子の間の距離と相互作用(相互作用がある場合)を評価するには、別のプロトコールが存在する。フローサイトメトリーはまた、膜電位、またはカリウムイオン、ナトリウムイオンおよび塩素イオンなどのイオンの相対的内部および外部濃度によって生成された膜を横切る電荷差を測定するためにも使用される。膜電位の変化は、神経インパルス伝播、筋肉収縮、細胞シグナル伝達およびイオンチャネルゲーティングを含む多くの生理学的過程において決定的な役割を果たす。特定のフローサイトメトリープローブで、イオンチャネル活性、最も一般的にはカルシウムまたはCa2+を直接観察することが可能である。細胞内Ca2+レベルは、遺伝子発現、細胞増殖および運動を含む多数の細胞プロセスを調節する。

フローサイトメトリーにおいて、細胞膜は実験を複雑にすることがある。細胞内のタンパク質、プロセスおよび物質を検出することが目的である場合、色素および標識抗体は膜を通過することが必要である。これは、特定の色素および蛍光色素の使用を排除し、特別な細胞調製が必要である。

細胞調製

フローサイトメーター用のサンプルには特別な配慮が必要である。これらの考慮と特定のプロトコルについて深く議論することは不可能であるので、いくつかの重要な概念のみを簡単に述べる。

脱凝集

単細胞懸濁液はすべてのフローサイトメトリーアッセイに必要である。そのようなものとして、特定のタイプの細胞(例えば、血液中の白血球)はフローサイトメトリーに非常に適している。しかしながら、この要件は、固形腫瘍または他の組織サンプルのフローサイトメトリー解析を排除するものではない。組織サンプルを適切な単細胞懸濁液に脱凝集 させるには、多数のプロトコールが利用可能である。これらのプロトコールは、通常、酵素的消化(例えば、コラーゲン性)または機械的な切断、および濾過を含む。多くの細胞株が培養フラスコのプラスチック表面に付着して成長するので、培養細胞は特別な処理、典型的には温和なトリプシン消化が必要な場合がある。あらゆる状況で、壊死組織片、死細胞、細胞凝集塊を取り除くことは実験の成功に不可欠である。

濃縮

歴史的に、まれな目的集団(例えば5%以下)を扱う場合、選別または分析の長さを短縮するために、これらの集団を濃縮する必要がある。濃縮の方法は多くあり、中には遠心分離、密度勾配、磁性粒子分離および補体媒介性の溶解が含まれる。高速フローサイトメーターの出現により、これらの手順はレア イベント検出の成功にもはや必要ではない。1秒間に100,000個のイベントを処理できる機器では、濃縮を行わないことが許容されている。このステップを排除することで、実験室の生産性が向上し、潜在的に有害な細胞操作が最小限に抑えられ、より正確なまれな集団統計が保証される。

膜透過性

細胞膜は抗体のような大きな分子に対して不透過性であるが、適切な細胞調製プロトコールに従えば、フローサイトメトリーで細胞内タンパク質を検出することができる。典型的には、タンパク質を安定化させるために、典型的にはホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し、続いて界面活性剤を用いて膜を破壊することを含む。固定剤と界面活性剤の選択、ならびにインキュベーション時間は、目的の細胞内タンパク質に依存して変化する。

参考文献

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