フローサイトメトリー (FCM) /FACS | 蛍光色素の選択

励起と放射

フローサイトメトリーでは、通常、レーザー光が蛍光色素を励起するために使用される。これらのレーザーは、UVおよび/または可視範囲の光を生成する。レーザーによって生成される光の波長で蛍光を発する能力に基づいて蛍光色素を選択する。したがって、フローサイトメーターが488nmの光のみを生成する1つのレーザのみを有する場合、488nmの光によって励起される蛍光色素のみが使用できる。蛍光色素の化学的性質は、その電子が特定の波長のレーザ光によってより高いエネルギー状態に励起されるかどうかを決定する。電子がより高いエネルギー状態に励起されることができる場合、蛍光色素の化学的性質はまた、電子が最も低い一重項励起状態に戻るときに、熱として失われるエネルギーの量、および電子が基底状態に戻るときに生成される光の波長を決定する。

蛍光色素の電子は、ある範囲の波長の光によって励起することができる。例えば、蛍光色素であるフルオレセインは、430nmと520nmの間の波長の光が当たると蛍光を発する。しかしながら、励起波長が495nmに近いほど、より多くの蛍光を生成する。この最適な波長は励起ピークと呼ばれる。 同様に、蛍光色素によって生成される光はある範囲の波長を有する。フルオレセインからの光の放射範囲は490nmから630nmであり、放射ピークは約520nmである。

蛍光色素の選択

蛍光化合物の励起および放射特性を知ることにより、蛍光色素の組み合わせを選択することが可能になる。これらの組み合わせは特定のフローサイトメーター上で特定のレーザーと共に最適に機能する。しかし、生物学的適用において有用な蛍光色素は、生物学的重要性のある粒子に付着するか、またはその中に含まれなければならない。いくつかの蛍光色素は、抗体、DNAまたはRNA中の核酸などの特定の化学構造に結合するので有用である。

フローサイトメトリーで最も頻繁に使用される蛍光色素は、生物学的に重要な分子に何らかの形で付着し、市販のフローサイトメーターで一般に見られるレーザーによって励起される蛍光色素である。多くの蛍光色素は抗体に結合することができ、続いて細胞上または細胞内の特定の化学構造に結合する。これらの化学構造が特定のタイプの細胞にとって独特である場合、蛍光色素はその細胞タイプを同定する。蛍光抗体を用いて細胞を同定するこの技術は、免疫表現型検査と呼ばれる。

表1に示されているのは免疫表現型検査において最も頻繁に使用される蛍光色素のリストである。励起ピーク、放射ピーク波長、およびフローサイトメーター上でそれらを励起 させることに最も頻繁に使用されるレーザー波長も記載されている。表2には、様々な蛍光色素を励起するのに必要な波長の光を発生させることができるレーザーが示されている。フローサイトメトリーにおける蛍光色素の他の一般的な適用には細胞内カルシウムの検出、細胞DNAまたはRNAの相対量の測定、および蛍光タンパク質をレポーター遺伝子として用いた転写レベルの測定などが含まれる。表4に示されているのはこれらの適用に使用される蛍光色素である。

Table1. 免疫表現型検査用蛍光色素

蛍光色素 励起ピーク (nm) 放射ピーク (nm) レーザーの波長 (nm)
AMCA 345 440 334-364, 351-356
Alexa 350 350 445, 334-364, 351-356
Marina Blue 365 460 334-364, 405, 407
Cascade Blue 395 420 405, 407
Cascade Yellow 400 550 405, 407
Pacific Blue 405 455 405, 407
Alexa 430 435 540 458
Per-CP 490 670 488
FITC 495 520 488
Alexa 488 500 520 488
Alexa 532 532 555 514
TRITC 545 580 568
Alexa 546 560 570 568
Phycoerythrin (PE) 565 575 488, 514, 568
PE-Texas Red 565 615 488, 514
PE-Cy5 565 670 488, 514
PE-Cy5.5 565 695 488, 514
PE-Cy7 565 770 488, 514
Alexa 568 568 605 568
Alexa 594 594 620 568
Texas Red 595 615 568
Alexa 633 630 650 633, 635, 647
Alexa 647 647 670 633, 635, 647
Allophycocyanin (APC) 650 660 633, 635, 647
Cy5 650 665 633, 635, 647
APC-Cy7 650 770 633, 635, 647
Alexa 660 660 690 633, 635, 647
Cy5.5 675 695 633, 635, 647
Alexa 680 680 700 633, 635, 647
Alexa 700 700 720 633, 635, 647

Table2. フローサイトメトリーにおける一般的なレーザーの波長

レーザー UV 青紫色 青色 青緑色 緑色 黄色 赤色
Argon 334-364   458 488 514    
Solid-State Violet Laser   405          
Krypton 351-356 407       568 647
Helium-Neon             633
Red Diode             635

Table3. BD FACSCaliburにおけるレーザーとチャンネルの組み合わせ

レーザー チャネル Filter Info 一般的なフルオロフォア 代替フルオロフォア
カルシウム FL-1 515-545nm FITC Alexa 488, GFP, YFP
カルシウム FL-2 564-601nm PE DsRed(RFP)
カルシウム FL-3 670LP PerCP PE-Alexa 700, PE-Cy5.5
カルシウム FL-4 653-669nm APC Cy5-Alexa 647, TOTO-3

Table4. その他のフローサイトメトリー適用のための蛍光色素

適用 蛍光色素 励起ピーク (nm) 放射ピーク (nm) レーザーの波長 (nm)
カルシウム Indo-1 (calcium) 325 400 334-364, 351-356
カルシウム Indo-1 (nocalcium) 345 485 334-364, 351-357
カルシウム Fura Red 485 675 458, 488
カルシウム Fluo-3 500 540 488
DNA量 Hoechst 33342 355 455 334-364, 351-356
DNA量 DAPI 360 460 334-364, 351-356, 405, 407
DNA量 Acridine Orange 495 535 488
DNA量 Propidium Iodide 305 620 334-364, 351-356
535 620 488, 514, 568, 633, 647
DNA量 7-AAD 545 650 488, 514, 568
DNA量 To-Pro-3 640 655 633, 635, 647
レポーター遺伝子 eCFP 430 475 458
レポーター遺伝子 eGFP 495 510 488
レポーター遺伝子 eYFP 520 535 514
レポーター遺伝子 Ds-Red 555 585 514, 568
レポーター遺伝子 HcRed 590 620 568

参考文献

1. Haugland RP. Handbook of fluorescent probes and research products. 9th ed. Eugene, OR: Molecular Probes; 2002.
2. Shapiro HM. Practical flow cytometry. 4th ed. New York: Wiley-Liss; 2003.