フローサイトメトリー (FCM) /FACS | 蛍光測定

異なる波長で行われる蛍光測定により、蛍光色素標識細胞表面受容体または細胞内分子(DNAおよびサイトカインなど)についての定量的および定性的データが取得できる。フローサイトメーターは、放出された光を検出するために別々の蛍光(FL-)チャネルを使用する。検出器の数は、装置およびその製造者によって異なる。検出器はシリコンフォトダイオードまたは光電子増倍管(PMT)である。シリコンフォトダイオードは、通常、信号が強いときに前方散乱光を測定するために使用される。PMTはより敏感な機器であり、散乱光および蛍光の測定に理想的である。

検出の特異性は、他のものを透過(通過)しながら特定の波長を遮断する光学フィルタによって制御される。主要に3つの種類のフィルタがある。Long-Pass(LP)フィルターは規定波長よりも短波長側の光をカットし、長波長側の光を透過させる。Short-Pass (SP) フィルターは規定波長よりも長波長側の光をカットし、短波長側の光を透過させる。Band Pass (BP) フィルターは一定の波長域の光のみ透過し、それ以外の短波長側および長波長側の光をカットする。これらのフィルターはすべて吸収によって光を遮断する。

フローサイトメーターにおけるバンドパスフィルタ

ロングパスフィルターはカットオン波長より上の波長を透過する。
バンドパスフィルタは、特定波長付近の狭い範囲の波長を透過する。

フローサイトメーターで検出された蛍光標識抗体

蛍光細胞がレーザビームを通過すると、時間の経過とともに光子放出のピークまたはパルスが生成される。これらはPMTによって検出され、イベントとして知られる電圧パルスに変換される。総パルス高さおよび面積は、フローサイトメーターによって測定される。測定された電圧パルス面積は、そのイベントの蛍光強度に直接相関する。

パルスの各時間スライスの高さ値を加算することによってパルス面積を計算する。その高さはアナログ・デジタルコンバータ(ADC)の速度によって決定する。それは10MHzである(すなわち、毎秒1000万または10マイクロ秒)

ヒストグラム

パルス強度(パルス面積)に基づいてこれらのイベントにチャネルが割り当てられる。PMTを通る電圧を上げることによってこの信号を増幅することができる。測定した強度に応じて各イベントにチャネル番号が与えられる。蛍光が強ければ強いほど、イベントが割り当てられるチャンネル番号が高くなる。チャネルは通常、x軸上の対数スケールで表示される。

ドットプロット(Dot plot)