フローサイトメトリー (FCM) /FACS | 蛍光活性化セルソーティング (FACS)

蛍光活性化セルソーティング(FACS)は、フローサイトメトリーの特殊なタイプであり、生物細胞の不均一な混合物を各細胞の特定の光散乱および蛍光特性に基づいて、一度に1つの細胞ずつ、2つ以上の容器に分類する方法である。個々の細胞からの蛍光シグナルを迅速で、客観的で定量的に記録でき、関心のある細胞の物理的分離が可能であるため、非常に有用な科学機器である。

細胞懸濁液は、狭くて急速に流れる液体の流れの中心に挟まれる。流れは、直径と比較して細胞間に大きな分離があるように配置される。振動機構は、細胞の流れを個々の液滴に崩壊する。液滴当たり1つ以上の細胞の可能性が低いようにシステムは調整される。流れが液滴に崩壊する直前に、フローは蛍光測定ステーションを通過し、各細胞の関心のある蛍光特性が測定される。帯電リングは、流れが液滴に崩壊するところにちょうど配置される。この前の蛍光強度測定に基づいて、リング上に電荷が置かれ、液滴が流れから崩壊するときに液滴に捕捉される。帯電した液滴は、液滴をその電荷に基づいて容器に転向させる静電偏向システムを通って落下する。いくつかのシステムでは、電荷は流れに直接アプライされ、崩壊する液滴は流れと同じ符号の電荷を保持する。液滴が崩壊した後、流れは中性に戻る。 

蛍光活性化セルソーティング (FACS)

蛍光活性化セルソーター (FACS).

特定の細胞表面タンパク質に特異的な抗体は、蛍光分子に結合し、次いで、細胞の混合物に添加する。特定の細胞がレーザービームを通過するときの蛍光について、それらはモニターされる。細胞が蛍光標識抗体を制限しているか否かに基づいて、単細胞を含む液滴に正または負の電荷が与えられる。単細胞を含む液滴は、その電荷によって電場によって検出され、収集管内に落ちる。

まず、特定の細胞表面分子に対して個々である抗体で目的のものを標識する。抗体は蛍光色素結合し、狭い流れの中で個々の細胞は一列に並べてレーザービームを通過するときのように、各細胞の蛍光が測定される。次いで、振動ノズルは小さな液滴を形成する。液滴はそれぞれ単一の細胞を含み、含有する細胞が蛍光を発するかどうかに基づいて負または正の電荷が与えられる。蛍光抗体で標識された細胞表面分子については、強い電場は、各容器が最終的に均質な細胞集団を有するように、種々の荷電した液滴を別々の容器に配る。生化学分析または培養物中で増殖させることの場合、これらの均一集団を使用することができる。フローサイトメトリーにより、細胞のRNAおよびDNA量も測定可能。

その後の培養のために、細胞は生細胞であり、汚染されてない必要がある。 以下のコツを参照してください。

• バッファーに血清が含まれる。
• 細胞に毒性を与え、生存率を低下させる可能性があるため、染色の間、緩衝液中にアジ化ナトリウムがないように注意してください。
• 細胞が汚染されないことを保証するために、実験は無菌滅菌条件で行う必要がある。
• 透過処理は細胞の生存率を損なう細胞膜の損傷を必要とするため、生細胞の選別前に細胞内染色を行うことは通常不可能である。