フローサイトメトリー (FCM) /FACS | コントロール

間接染色の実験では、このポリクローナル抗体と死細胞または粘着細胞の非特異的結合を制御するために、二次抗体のみで細胞を染色することが非常に必要である。これは、蛍光強度が特異的であると考えられるレベルを上回る、いわゆる「二次コントロール」である。二次抗体のみで染色した細胞の強度を、染色されていない細胞のバックグラウンド自己蛍光と比較することにより、通常、二次試薬の問題を診断できる。理想的には、二次コントロールは染色されていない細胞よりも明るくない。

多色実験のためのスペクトルクロストーク補償を設定するために単一染色細胞を有することも絶対に必要である。しかしながら、直接プロトコールで細胞を染色する場合、適切な陰性対照の問題についてかなりの議論がある。 陽性細胞が染色されていない(自己蛍光)細胞よりもはるかに明るい場合、そして細胞が染色されていないサンプルが実験に含まれている場合、おそらく染色されたサンプル内の染色されていない細胞それ自体が非特異的染色のコントロールと言える。しかし、実験で、いわゆるアイソタイプコントロール抗体で染色されたサンプルが含まれている場合、ほとんどの人にとっては、死細胞やFc受容体結合の問題を排除することが望まれる。

アイソタイプ対照抗体とは、問題の細胞に対する特異性を有さないが、実験に使用される抗体の全ての非特異的特徴を有する抗体である。抗体は異なる結合特性を有する異なるクラス(「アイソタイプ」)を有するので、実験では染色に使用される抗体の各クラスに対してアイソタイプ対照抗体を有するべきである。そのような抗体は、フローサイトメトリー試薬の製造者から入手可能である。

懐疑主義は使用しているすべての抗体のタンパク質濃度を知り、これらの抗体のそれぞれに結合した蛍光色素分子の数を知る私たちの能力に疑問を持つだろう。多くの染色のパネルにおける各染色は、異なるアイソタイプ、異なる濃度、および異なるF/P比を有する可能性があり、したがってそれ自身の制御が必要となるため、妥協がたぶん必要である。

完璧な答えはない。コントロールの要件は、通常、実験の性質によって決定される。また、結果データについて尋ねられた質問の厳格さに関して注意深く検討する必要がある。

バックグラウンドコントロールについての推奨事項」 をクリックすると、コントロール設定の詳細が見られる。