フローサイトメトリー (FCM) /FACS 適用 | 実験

フローサイトメトリーは、細胞、細菌および他の微生物などの微粒子を効率的に分析し、光学、流体工学、電子工学、コンピュータ技術を統合している一般的な方法である。数多くの先端技術を応用することにより、フローサイトメーターは小型化、低価格化、高速化、高集積化、高性能化になっている。

臨床実験室では、白血病とリンパ腫の解析、微小残存病変の検出、幹細胞列挙、T 細胞クロスマッチ、術後モニタリング、自己抗体の検出、HIV感染、母児間輸血症候群、免疫不全疾患、発作性夜間血色素尿症、網赤血球の解析、汚染白血球、赤血球 (RBC)の測定、血小板計数および機能、品質管理などの用途に使用されている。

免疫学では、リンパ球亜集団の分析、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の検出、細胞および体液中のサイトカインの検出、感染とその治療効果の観察などに使用されている。

細胞生物学において、フローサイトメトリーは、細胞アポトーシス、細胞周期、Ca2+濃度、細胞内pHなどの検出および細胞選別に使用することができる。

RA患者の滑膜B細胞によって産生したRANKLの検出

NFκB活性化受容体リガンド(RANKL)は骨代謝において重要であり、骨代謝を促進する重要なサイトカインである。RANKLの発現はフローサイトメトリーによって検出できる。末梢血および滑液単核細胞を、抗CD19およびアイソタイプ・コントロールまたは抗RANKL抗体のいずれかと共に標識する。結果によると、リウマチ関節(RA)患者の末梢血におけるごく少数の割合のB細胞しかRANKLを発現しておらず、滑液試料からの高い割合のB細胞が、表面上にRANKLを発現した。これは、B細胞が炎症を 起 こしたリウマチ関節におけるRANKL産生に寄与していることを報告する初めての研究であり、RANKL発現B細胞の枯渇がリツキシマブによる骨侵食の阻害に寄与し得ることを示す可能性がある。

参考文献:Lorraine Yeo, Kai-Michael Toellner, Mike Salmon, Andrew Filer, Christopher D Buckley, Karim Raza, Dagmar Scheel-Toellner. Cytokine mRNA profi ling identifi es B cells as a major source of RANKL in rheumatoid arthritis. British Medical Journal 2011, doi:10.1136/ard.2011.153312

骨肉腫における細胞表面受容体の検出

骨肉腫は小児癌の最も一般的な形態の1つであり、多数の細胞シグナル伝達受容体を有する。現在の研究では、フローサイトメトリーを用いて様々な骨肉腫細胞株上の細胞表面受容体の発現を特徴づけ、定量化しようとしている。
これらの受容体にはヒト内皮増殖因子受容体 (HER)-2、 HER-3、HER-4、インスリン様増殖因子 1 受容体 (IGF-1R) 、IGF-2R、インスリン受容体(IR) 、血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)-1、VEGFR-2、VEGFR-3、c-Met、線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)-2、FGFR-3、および血小板由来増殖因子受容体 (PDGFR)-βなどが含まれる。
結果によると、IGF-2Rが有意な過剰発現を有する。c-Met、PDGFR-β、IR、IGFR-1、HER-2、およびVEGFR-3に可変発現パターンが見られ、これはこれらの受容体が骨肉腫の攻撃性および生物学的異種性に寄与し、また、腫瘍のサブセット内の潜在的な標的として役立ち得ることを示している。関連する受容体発現は、一般的な調節因子または経路への新たな洞察を提供する。一般的な因子を標的とするか、または複数の特異的受容体を標的とすることは、治療上の関連性を有し得る。
参考文献: Hassan SE, Bekarev M, Kim MY, Lin J, Piperdi S, Gorlick R, Geller DS. Cell surface receptor expression patterns in osteosarcoma. Cancer 2011, doi: 10.1002/cncr.26339

乳がん細胞におけるタンパク質CD44の検出方法

CD44はシグナル伝達を媒介するためにヒアルロン酸を細胞骨格アンキリンに連結する細胞膜受容体である。細胞遊走、分化および生存シグナル伝達において役割を果たし、正常細胞および癌細胞の両方にとって重要である。CD44のブロッキングは腫瘍の悪性活動を減少させる。
ヒト乳癌細胞株MCF-7 / CD44st細胞(pcDNA3.1-CD44stでトランスフェクトしたMCF-7細胞)、MCF-7細胞およびMCF-7 / neo細胞(pcDNA3.1でトランスフェクトしたMCF-7細胞)におけるCD44タンパク質の発現はフローサイトメトリー分析を用いて検出された。これらの細胞株のうち、MCF-7 / CD44st細胞のみが高レベルのCD44タンパク質を発現した。そして、pcDNA3.1-CD44stで安定にトランスフェクトした細胞は首尾よく構築された。
この検出方法は、HAが新しいCD44stと相互作用し、MMP-2およびMMP-9の発現を調節し得ることを実証するのに寄与する。これは、Ras / MAPKシグナル伝達経路を介してMCF-7細胞の浸潤能力を増加させる可能性がある。

参考文献:Fang XJ, Jiang H, Zhao XP, Jiang WM. The role of a new CD44st in increasing the invasion capability of the human breast cancer cell line MCF-7. BMC Cancer 2011, 11(1):290.

HLAクラスIは、胃腸腫瘍の末梢Tリンパ球およびNK細胞をダウンレギュレートする

ヒト白血球抗原(HLA)クラスIは、免疫応答の調節において重要な役割を果たす細胞表面糖タンパク質である。よく知られているように、腫瘍細胞上のHLAクラスIの全部または一部の喪失は、腫瘍逃避の主要なメカニズムの1つである。Tリンパ球およびNK細胞は免疫防御の2つの重要なエフェクター細胞として、豊富なHLAクラスIを発現する。
Tリンパ球およびNK細胞の割合およびその表面上のHLAクラスIのレベルは、フローサイトメトリーによって測定することができる。結果は、末梢血単核細胞におけるTリンパ球およびNK細胞の割合は年齢とともに変化しないことが示された。一方、末梢Tリンパ球およびNK細胞上のHLAクラスIの発現レベルは、年齢または性別によって影響されなかった。しかし、低リスク群と比較して、高リスク群の末梢Tリンパ球およびNK細胞上のHLAクラスIは有意な減少を示した。
末梢Tリンパ球およびNK細胞上のHLAクラスIは、腫瘍形成および胃腸腫瘍の発症に関与する可能性があり、それらの発現の変化を理解することは、腫瘍免疫のメカニズムへの新たな洞察を提供する。

図1 末梢血Tリンパ球、NK細胞およびHLAクラスI発現のゲート。A:総リンパ球を末梢血から分離した(ゲート1)。B: Tリンパ球(ゲート2)およびNK細胞(ゲート3)を総リンパ球から分離した。C: Tリンパ球上のHLAクラスIの平均蛍光強度。D: NK 細胞上のHLAクラスIの平均蛍光強度。

参考文献:  Zhang ZM, Li YJ, Guan X, Yang XY, Gao XM, Yang XJ, Wang LS, Zou X. Down-regulation of human leukocyte antigens class I on peripheral T lymphocytes and NK cells from subjects in region of high-incidence gastrointestinal tumor. Chin Med J (Engl) 2011, 124(12):1813-7.

Pneumocystis carinii (ニューモシスチス・カリニ)のセルソーティング

Pneumocystis jiroveciiは重症肺炎(PcP)を引き起こし、免疫不全HIV陰性個体において引き続き注目されている。例えば、原発性免疫不全を有する患者、悪性腫瘍、臓器移植または自己免疫疾患に対する免疫抑制療法を受けている患者など。真菌種を用いてラットに感染し、フローサイトメトリーによってその生命周期の段階を分選することにより、伝染効率、トランスクリプトームまたはそれらの倍数性レベルを研究することは生命周期をさらに理解するための一歩である。

結果は、P.cariniiの生物のほとんどが一倍体であることを示した。嚢胞性形態では、8種類のDNA量が測定されたので、各成熟した嚢胞は8つの一倍体胞子を含み、各胞子は栄養型に進化するという事実を強める。P. cariniiの生命周期段階の倍数性データは、その増殖様式の複雑さを明らかに示した。


図1選別されたP. carinii生物の代表的な細胞周期分析ヒストグラム。次のDNA量:(A)すべての選別されたP.cariniiの生命周期の段階; (B)選別されたP.carinii栄養型; (C)一倍体出芽酵母参照株; (D)選別されたP.carinii嚢胞形態; (E)二倍体出芽酵母参照遺伝子。 図2 P. carinii生命周期と細胞周期の解釈模式図

参考文献:  Anna Martinez, El Moukhtar Aliouat, Annie Standaert-Vitse, et al. Ploidy of Cell-Sorted Trophic and Cystic Forms of Pneumocystis carinii. PLoS One. 2011;6(6):e20935.

胃癌細胞のアポトーシスと細胞周期に及ぼす茶の成分の影響

お茶は健康に有益であるため、広く普及している。一般に、茶は、製造方法によって不発酵茶(緑茶)、発酵茶(紅茶)および後発酵茶(プーアル茶)に分類することができる。これらの3種類の茶は抽出物の化学成分が異なる。発酵紅茶およびプーアル茶では多糖類およびカフェインのレベルが実質的に高く、不発酵茶緑茶ではポリフェノールのレベルが高い。この異なりは、アポトーシスおよび細胞周期停止に明確な影響を及ぼす。

結果によると、主な茶フェノール化合物であるカテキン類は、胃癌細胞株SGC-7901の早期アポトーシスを誘発することができることが示されている。発酵プロセスの間に、フェノール化合物の含量が減少した。細胞周期の結果によると、G2 / M相細胞の割合は発酵プロセスによって減少する。これは茶ポリフェノールの酸化とtheabrowninの増加による起因する可能性がある。また、茶抽出物およびそれらの成分は、正常なCCC-HEL-1細胞に対してより低い細胞傷害性を有することも示されている。細胞周期は、高濃度処理に影響されなかった。これらの結果は、茶抽出物およびそれらの成分が胃癌治療の候補薬剤になる可能性があることを示している。

図1 SGC-7901およびCCC-HEL-1細胞の48時間の処理によって誘導される細胞アポトーシスのフローサイトメトリー解析。. 図2 3種類の茶抽出物およびそれらの主要成分による処理後のSGC-7901およびCCC-HEL-1細胞の細胞周期解析。

参考文献:  Hang Zhao, Min Zhang, Lu Zhao, Ya-kun Ge, Jun Sheng and Wei Shi. Changes of Constituents and Activity to Apoptosis and Cell Cycle During Fermentation of Tea. Int. J. Mol. Sci. 2011 12: 1862-1875; doi:10.3390/ijms12031862