ELISAトラブルシューティング - OD読み値が低い

ELISAにおいて、光学濃度測定はしばしば低い光学濃度(OD)測定値を与えます。それはシグナルが低かったり弱かったりする一方で、96ウェルプレートでの発色も不十分です。この部分は、ELISAの発色が不十分であるという問題の考えられる原因および対応するトラブルシューティングを推奨することを目的としています。

発色しない
Development
再現性が低い
Reproducibility
考えられる原因 推奨されるトラブルシューティング
実験室の温度が低すぎる。 18℃〜25℃の範囲で室温を維持してください。エアコンの通気口や寒い窓の近くでは、アッセイを行わないでください。
洗浄溶液は正しく調製されていないか、間違った洗浄溶液が使用された。 キットに推奨されている洗浄液を使用し、正しく調製されていることを確認してください。誤った洗浄液を使用しないように、各洗浄液にラベルを付けてください。
洗浄システムには微生物汚染があったか、ほかの洗浄処方が含まれた。 漂白剤の希釈溶液(10% by volume)でシステムを洗い流し、続いて大量の蒸留水または脱イオン水で微生物汚染を清掃する。その後、システムに適切な洗浄液を注入する。それぞれの洗浄液に適切なラベルが貼られていることを確認する。溶液を切り替えるときは、システムに完全に注入してください。
洗浄回数が多すぎた。 洗浄回数の推奨範囲で使用してください。アッセイに推奨される最小の洗浄回数を使用してみてください。
インキューベーション時間が短すぎた。 インキュベーション時間はプロトコールに従ってください。 正確なインキュベーション期間を確保するために各プレートを別々に計時しましょう。
試薬とプレートは寒すぎた。 アッセイを開始する少なくとも2-3時間前に、プレートと試薬を冷蔵庫から取り出し、室温になっていることを確認する。キットボックスからキットコンポーネントを取り出す。
試薬が失効したか、異なるロット番号と混在していた。 試薬の有効期限およびロット番号を確認しましょう。
間違ったコンジュゲートを使用したか、コンジュゲートが正しく調製されなかったか、または劣化した。 使用したコンジュゲートはキットに付属しているコンジュゲートであり、すべてのコンジュゲートはキットとロット特異的であることを確認してください。作業コンジュゲートの調製が必要な場合は、濃縮液と希釈液が適切な容積で混合されていることを確認してください。あまりにも先に作業ソリューションを準備しないでください。また、未使用の部分を将来の使用のために保存しないでください。コンジュゲート調製が必要がない場合は、すぐに使用する量だけ注ぎ出し、使用していない部分はストックボトルに戻さないでください。
アッセイプレートの読み取りが間違った波長での数値であったか、またはリーダーが機能していなかった。 アッセイの正しい波長を確認し、プレートをもう一度読んでください。 リーダーの校正とランプの位置合わせを確認してください。
陽性対照を希釈した(間接的フォーマットのみ)。 添付文書に明記されていない限り、コントロールを希釈しないでください。
過度のキットストレスが発生した。 記録をチェックして、キットが冷蔵庫から何回循環したかを確認しましょう。キットが発送センターまたは他の場所に長時間、または極端な温度で放置されたかどうかを確認してください。
アッセイプレートが損傷したか、使用されたことがある。 安定性を維持するために、密封された袋の中にプレートを乾燥剤で冷やしてください。パッケージ内で室温に平衡させることにより、プレート上に結露が形成されないようにする。部分プレートを使用する場合は、使用済みのウェルにラベルを付けて再使用を避けるようにしてください。 シーリングテープで覆い、できるだけ早く残りのウェルを使用してください。部分的に使用されたプレートを他のプレートと共に保管しないでください。 保管袋に乾燥剤を入れてください。
マイクロタイタープレートにコーティングされた抗原は足りなかった。 コーティングのための抗原の量を増やす。
使用された抗体は足りなかった。 一次および/または二次抗体の濃度を増加させる。アッセイの抗体濃度を最適化する。
検出試薬が薄すぎる。 より高濃度の検出試薬を使用してください。