ELISAプロトコール

プレートの準備

1.CBSの作業濃度まで捕獲抗体を希釈する。96ウェルマイクロプレートに、希釈した100μL/ウェルの捕獲抗体を直ちに塗布する。 プレートを密封し、4℃で一晩インキュベートする。
2.各ウェルを吸引し、少なくとも300μlの洗浄緩衝液で洗浄する。このプロセスを2回繰り返して合計3回洗浄する。良好な性能を得るには、各ステップで液体を完全に除去することが不可欠である。プレートを反転させ、きれいなペーパータオルで拭き取って、残りの洗浄バッファーをすべて除去する。
3.各ウェルに300μLのブロッキングバッファーを加えてプレートをブロックする。室温で最低1時間インキュベートする。
4.ステップ2と同様に吸引/洗浄を繰り返す。これで、プレートにサンプルを加える準備が整った。

アッセーの手順

1. 各ウェルに100μLのサンプルまたはスタンダードをサンプル希釈バッファーに加える。プレートを密封し、室温で2時間インキュベートする。
2. プレートの準備のステップ2と同様に吸引/洗浄を繰り返す。
3.各ウェルに抗体希釈バッファーに希釈された100μLの検出抗体を加える。プレートを密封し、室温で1時間インキュベートする。
4. プレートの準備のステップ2と同様に吸引/洗浄を繰り返す。
5.各ウェルに200 μLの基質溶液を加える。室温で20分間インキュベートする(基質溶液が要求に合わない場合は、インキュベーション時間を最適化する必要がある)。プレートを直射日光の当たる場所に置かないでください。
6.各ウェルに50 μLの反応停止液を加える。静かにプレートをタップして完全に混合させる。
7.450 nmに設定されたマイクロプレートリーダーを使用して、すぐに各ウェルの光学密度を決定する。

結果の算出

1.各組の重複スタンダード、対照品およびサンプルの平均吸光度を計算する。それぞれから平均ブランクスタンダード吸光度を差し引く。
2.各標準の平均吸光度をy軸上でx軸上の濃度に対して描き、標準曲線を作成する。そしてグラフ上の点を通じて最適な曲線を描く。
3.未知物質の濃度を決定するには、未知数の平均吸光度値をy軸上で見つけ、標準曲線に水平線を引く。交差点で、x軸に垂直線を引いて濃度を読み取る。サンプルが希釈されている場合は、読み取った濃度に希釈倍数を掛ける必要がある。
4.あるいは、コンピュータベースの曲線あてはめ統計ソフトウェアを使用して、サンプルの濃度を計算することもできる。