ELISAキットのプロトコール

試薬の準備
使用前にすべての試薬を室温に戻してください。結晶が緩衝溶液中で形成された場合、室温に暖め、結晶が完全に溶解するまで穏やかに混合してください。

アッセーの手順
すべての試薬とサンプルを室温に戻してから使用してください。すべてのサンプルと標準物質を二重にアッセイすることをお勧めします。
1.前のセクションの指示に従って、すべての試薬、作業標準、およびサンプルを準備します。

2.未使用のマイクロプレートストリップをプレートフレームから取り外し、乾燥剤パックを含むホイルパウチに戻して再びシールします。

3.スクリューボトル、マルチチャンネルピペット、マニホールドディスペンサーまたはオートワッシャーを使用して、各ウェルを3回洗浄バッファー(300μL/ウェル)で洗浄します。良好な性能を得るには、各ステップで液体を完全に除去することが不可欠です。吸引またはデカンテーションにより残りの洗浄バッファーをすべて除去します。プレートを逆さまにして、きれいな紙タオルで拭き取ります。

4. ウェルごとにゼロ標準品を含む連続希釈したタンパク質標準品または試験サンプルをそれぞれ100μL添加します。試薬の添加が中断されず、15分以内に完了するようにしてください。プレートをカバー/シールし、室温で2時間インキュベートします。

5. ステップ3と同様に吸引/洗浄を繰り返します。

6.各ウェルに作用濃度の検出抗体100μLを加えます。プレートをカバー/シールし、室温で1時間インキュベートします。

7. ステップ3と同様に吸引/洗浄を繰り返します。


8.基質溶液200μLを各ウェルに加えます。室温で20分間インキュベートします。光から避けてください。

9.各ウェルに50μLの停止液を添加します。色の変化が均一でない場合は、プレートを軽くたたいて完全に混合させてください。

10. 450 nmに設定されたマイクロプレートリーダーを使用して、20分以内に各ウェルの光学密度を決定する。

結果の算出
サンプルが最高標準よりも高い値を生成する場合は、サンプルを希釈し、アッセイを繰り返します。各スタンダード、コントロールおよびサンプルの平均吸光度を計算し、平均ゼロ標準光学濃度(O.D.)を差し引く。

x軸上の濃度に対して各標準の平均吸光度をy軸上にプロットして標準曲線を作成し、グラフ上の点を介して最適な曲線を描く。ほとんどのグラフ作成ソフトウェアは曲線を作成するのに役立ち、4つのパラメータのロジスティック(4-PL)が通常最良適合を提供するが、最も正確なものを見るために他の方程式(例えば線形、対数/対数)も試みることがお薦めする。描いた標準曲線から未知サンプルの標的タンパク質濃度を推定する。