ELISA& 免疫沈降/IP

免疫沈降は、沈降可能なマトリックスに付着した特異的抗体に結合することによって抗原を単離する技術である。また、ゲル濾過や密度勾配沈降などの他の技術によって分離されたタンパク質分画を分析するためにも使用される。免疫沈降のための抗原の供給源は、非標識細胞または組織、代謝的または内在的に標識された細胞、またはインビトロ翻訳タンパク質であり得る。このユニットでは、種々の手段によって溶解された懸濁細胞または接着細胞を用いた広範囲の免疫沈降技術が記載された。通常、プラズマ導入された細胞または天然細胞は、免疫沈降のための理想的な試料である。

試料からの抗原は表面に付着する。次に、抗原に結合することができるように、表面上にもう一つの種類の特異的な抗体を添加する。この抗体は酵素に連結されており、最後のステップで酵素基質を含む物質を添加する。その後の反応は、検出可能なシグナルを生成する。それは最も一般的には、基質における色の変化である。

ELISAを行うことは、特定の抗原に対して特異性を有する少なくとも1つの抗体に関与する。未知量の抗原を有する試料は、非特異的(表面への吸着による)または特異的に(「サンドイッチ」ELISAにおいて、同じ抗原に特異的な別の抗体による捕捉を介して)固体支持体(通常はポリスチレンマイクロタイタープレート、詳細はELISA装置の節をご参照ください)上に固定化される。抗原が固定化された後、検出抗体を加え、抗原と複合体を形成する。検出抗体は、酵素に共有結合させることができ、またはそれ自体が、生体抱合を介して酵素に連結された二次抗体によって検出することができる。通常、各ステップの間で、プレートを温和な界面活性剤溶液で洗浄し、特異的に結合していないタンパク質または抗体を除去する。最後の洗浄ステップの後、酵素基質を加えて可視シグナルを生成することによりプレートを発色させ、サンプル中の抗原の量が示される。

さらに、免疫沈降抗体を磁気ビーズに結合させることによって、サンプル中の抗原が捕捉され、濃縮され、ELISA検出に用いることだできる。この方法では、通常のELISA手順によって検出することができる多くの標的タンパク質も検出することができる。