直接ELISA

1.pH 9.6、50 mM のNa2C03で試験抗原を10 μg/ml から 0.01 ng/mlまで希釈し、または抗体に基づいて適切な濃度まで調節する。ELISAプレート(96ウェルプレート)をコートする。100 μl/ウェルで、プレートを密封し、4℃で一晩インキュベートする。

2.プレートをPBS-T(0.05 % Tween-20 in PBS)で3回洗浄する。

3. 室温でのPBSの中の0.2%の脱脂粉乳でプレートを4℃で1時間ブロックする。
注意:牛乳は完全に溶解されるべきである。0.5gのミルクを50mlのPBS(1%)に回転または攪拌しながら室温で少なくとも30分間溶解させた後、0.2%に希釈し、室温でさらに10~15分間回転または攪拌を続けることが推奨される。高いバックグラウンドがあった場合、1%ミルク含有PBSをブロッキングおよび抗体希釈の両方に適用することができる。

4.プレートをPBS-Tで3回洗浄する。

5. (a) ビオチン標識でアフィニティー精製したウサギIgG(0.1-0.5 μg/ml in PBS, 100 μl/well)を室温で1時間インキュベートし、続いてPBS-Tで6回洗浄し、次いで8aに進む。
(b)あるいは、アフィニティー精製したウサギIgG(0.2-1 μg/ml in PBS, 100 μl/well)と共に室温で1時間インキュベートし、続いてPBS-Tで6回洗浄し、次いで8bに進む。

6. (a) HRP-Streptavidin (1:4000-10,000 dilutions)と共に0.2 % milk-PBS、100 μl/well、室温という条件で1時間インキュベートする。
(b) HRP-anti-rabbit IgG (1:3,000-10,000 dilutions of 1 mg/ml or 0.25 μg/ml)とともにPBS、100 μl/well、室温という条件で1時間インキュベートする。

7. PBS-Tで8回洗浄する。

8.基質(100μl/ウェル)としてTMBを用いて発色させ、室温で15〜30分間振盪せずにインキュベートする。

9. 2N H2S04(100μl/ウェル)を添加することにより反応を停止させる。反応が停止してから30分以内に、プレートリーダー上で450 nmでの吸光度を記録する。

特定プロトコルの詳細情報