直接ELISA プロトコール

1. 試験抗原でELISAプレート(96 ウェルプレート)をコートします(10 μg/ml to 0.01 ng/ml in 50 mM Na2C03, pH 9.6, adjust based on the reactivity of antibody, 100 μl/well.) 。プレートをシールし、4℃で一晩インキュベートします。
2. PBS-T(0.05 % Tween-20 含有PBS)でプレートを3回洗浄します。
3.室温で0.2%脱脂粉乳をPBS中に融解させ、プレートを4°C で1時間ブロックします。
注:牛乳は完全に溶解するべきです。0.5gのミルクを50mlのPBS(1%)に回転または攪拌しながら室温で少なくとも30分間溶解させた後、0.2%に希釈し、室温でさらに10~15分間回転または攪拌を続けることをお勧めします。高いバックグラウンドがある場合、1%ミルク含有PBSをブロッキングおよび抗体希釈の両方に適用することができます。
4. PBS-Tでプレートを3回洗浄します。
5.(a)ビオチン化アフィニティー精製したウサギIgG(0.1-0.5 μg/ml in PBS, 100 μl/well)と共に室温で1時間インキュベートし、続いてPBS-Tで6回洗浄し、次いで8a に進みます。
(b)または、親和性精製ウサギIgG(0.2-1 μg/ml in PBS, 100 μl/well)と共に室温で1時間インキュベートし、続いてPBS-Tで6回洗浄し、次いで8bに進みます。
6.(a) HRP-ストレプトアビジン(1:4000~10,000希釈)を含む0.2%ミルク-PBS(100μl/ウェル)と共に室温で1時間インキュベートします。
(b) HRP-anti-rabbit IgG (1:3,000-10,000 dilutions of 1 mg/ml or 0.25 μg/ml)を含むPBS(100μl/ウェル)とともに室温で1時間インキュベートします。
7. PBS-Tでプレートを8回洗浄します。
8. 基質(100μl/ウェル)としてTMBを用いて発色させ、室温で15〜30分間振盪せずにインキュベートします。
9. 2N H2S04(100μl/ウェル)の添加により反応を停止します。反応を停止してから30分以内に、プレートリーダー上で450 nmでの吸光度を記録します。