競合ELISAプロトコール

1.ほとんどのアプリケーションは、ポリ塩化ビニル(PVC)マイクロタイタープレートが最適であるが、タンパク質結合のための最も適切なタイプのプレートを決定するために、メーカーのガイドラインを参照してください。

2. 希釈された50μLの一次抗体(捕獲)を各ウェルに添加する。試料を試験する前に、チェッカーボード滴定を用いて適切な希釈度を決定する必要がある。PVCは約100ng /ウェル(300ng/cm2)で結合する。使用される抗体の量は個々のアッセイに依存するが、最大限の結合が必要な場合は、少なくとも1μg/ウェルを使用する。これはウェルの能力をはるかに上回るが、結合がより迅速に行われ、結合溶液を保存して再び使用することができる。室温で4時間または4℃で一晩インキュベートする。メモ:利用できる精製された捕捉抗体がない場合、まず以下の手順に従って、捕捉抗体の宿主に対する精製二次抗体でプレートをコーティングするべきである。
a.各ウェルに約50μLの抗体溶液(20 μg/mL in PBS)を添加することにより、未標識の二次抗体を各ウェルの底に結合させる。
b.プレートを4℃で一晩インキュベートして、完全に結合させる。
c.一次捕獲抗体を添加する(上記のように)。

3.ウェルをPBSで2回洗浄する。500mLの噴出ボトルが便利である。抗体溶液洗浄液は、適切な容器上でプレートを軽く打つことによって除去することができる。

4. マイクロタイタープレート上の残りのタンパク質結合部位はブロッキング緩衝液と共にインキュベートすることによって飽和させなければならない。0.02%アジ化ナトリウムを含む3%BSA/PBSでウェルを上部に満たす。室温で湿度の高い環境で2時間から一晩までインキュベートする。

5. ウェルをPBSで2回洗浄する。

6. 50μLのスタンダードまたはサンプル溶液をウェルに添加する。 全ての希釈は、ブロッキング緩衝液(0.05%Tween-20を含む3%BSA/PBS)の中で行うべきである。
注意事項:アジ化ナトリウムは阻害剤または西洋ワサビペルオキシダーゼである。HRP標識の結合物を検出に使用する場合、アジ化ナトリウムを緩衝液または洗浄液に添加しないでください。

7. 50μLの抗原結合物溶液をウェルに加える(抗原溶液を滴定すべきである)。全ての希釈は、ブロッキング緩衝液(0.05%Tween-20を含む3%BSA/PBS)中で行うべきである。湿度の高い環境で室温で少なくとも2時間インキュベートする。

8. プレートをPBSで4回洗浄する。

9.マーカーの説明に従って基質を添加する。お勧めのインキュベーション時間が経過した後、ELISAリーダーで標的波長における光学密度を測定することができる。
ノート: 競合ELISAは逆カーブを生じ、サンプルまたはスタンダードにおける抗原の値が高いほど色の変化量が少なくなる。