発色アッセイ

発色アッセイは、可視範囲の光を吸収する着色反応生成物を生じる。固体担体上に形成された抗原 - 抗体複合体は、洗浄によって他の物質から分離される。抗体を酵素で標識した。酵素の基質を添加した後、基質は酵素の触媒作用下で着色物質になり、これは被験物質の量に直接関係する。反応生成物の光学密度は、典型的には、測定される分析物の量に比例する。酵素の非常に高い効率のために、反応を高感度で大きく拡大することができる。

光吸収の原理

ランベルト・ベールの法則: logI0 / I = ε•C •b。光学濃度(OD)とも呼ばれる吸光度は濃度に比例する。

抗体を標識する2つの最も一般的な酵素は、アルカリホスファターゼ(AP)および西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)である。
1 AP
大腸菌から抽出されたアルカリ性ホスファターゼは、最適pHが8.0で、サイズがペルオキシダーゼ(MW〜80kD)の約2倍である。ウシ腸内から抽出されたAPはMWは100kDであり、最適pHは9.6である。これは、一般的に、酵素対抗体結合比が低いことを意味する。これはまた、より大きな分子サイズのアルカリホスファターゼが、密集した抗原-抗体複合体のために立体障害の問題を引き起こし得ることを意味する。これは、結合した酵素分子の推定数について予測される活性より低いことをもたらし得る(時にはHigh-dose hook現象の原因と考えられる)。アルカリホスファターゼは、ペルオキシダーゼよりもわずかに高価ですが、より安定していると考えられる。アルカリ性ホスファターゼの基質は、可溶性から不溶性の範囲である。それらの多くの信号が感度を高めるために強化することができる。不溶性反応生成物を生成する最も一般的な基質は、BCIP/NBT(5-bromo- 4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitroblue tetrazolium)である。安定性および光に暴露されたときの退色に対する耐性のために、イムノブロットにとって最も有効な基質だと考えられる。可溶性反応生成物を生成する最も広く使用される基質はp-NPP(p-ニトロフェニルホスフェート)である。それは、405〜410nmで測定可能な強い黄色を生成する。この基質の利点は、対応する感度の増加を得るために長期間発色させることが可能であることである。通常、p-NPPは反応速度が遅く、1N NaOHで停止する前に最適な発色に達するまでに30〜60分かかる必要がある。動態解析にはお勧めしない。化学反応は以下の通りである:

アルカリホスファターゼの使用に伴う主な欠点は、キレート剤、酸性pH(<4.5)または無機リン酸塩によって不活性化されることである。これは、緩衝液がアルカリ性ホスファターゼに特異的でなければならず、アッセイ中に酵素と接触する希釈剤または洗浄溶液として標準的なアッセイリン酸緩衝化生理食塩水2溶液を使用することはできないことを意味する。しかしながら、キレート剤(EDTA)および酸性pHは、アルカリホスファターゼ反応のための便利で安価な停止試薬としてよく使用される。

プロパティ:バックグラウンドが低く高感度、しかしより高価。

2 HRP
ペルオキシダーゼは、通常4:1の比で抗体に結合され得る約18%(MW〜44kD)の糖を有する糖タンパク質である。それは、アポ酵素(酵素)と補欠分子族(ヘム)とからなるポルフィリンタンパク質の組み合わせである。アポ酵素は、275nmに最大吸収ピークを有する無色糖タンパク質である。補欠分子族は、暗褐色の鉄ポルフィリン環であり、403nmに最大吸収ピークを有する。そのサイズが小さいため、表面上に結合した抗体/抗原複合体で立体障害の問題を生じることはめったにない。ペルオキシダーゼは、アルカリホスファターゼと比較して非常に安価である。カタラーゼに適用する様々な市販の基質が存在する。反応によりは可溶性または不溶性生成物を生成することができる。すべてのペルオキシダーゼ反応は過酸化水素を必要とするので、市販の基質を購入することが推奨される。なぜならこれらの調製物は安定した過酸化水素を含み、価値と有用性がもっと大きいからである。ペルオキシダーゼの主な欠点は、多くの防腐剤(アジ化ナトリウムなど)とは適合しないことであり、多くの生物学的緩衝溶液中の微生物汚染を低減するために使用される。アジ化ナトリウムは、低濃度であっても、ペルオキシダーゼを不活性化する。ペルオキシダーゼ活性を妨害する他の化合物または元素は、水中に見出される金属および生物学的試料中に見出される内因性ペルオキシダーゼである。これらの欠点は、防腐剤を含まない滅菌緩衝液、試薬グレードII型水を使用すること、およびアッセイに使用する前に過酸化水素で高ペルオキシダーゼレベルを有することが疑われる分析物を前処理することによって克服することができる。一般的には、酵素を添加する前に非結合生物成分を洗い流すので、内因性ペルオキシダーゼ活性は一般的に問題にならない。不溶性生成物を生成する3つの最も一般的な基質は、TMB(3,3',5,5' tetramethylbenzidine)、DAB(3,3',4,4' diaminobenzidine)、および4CN(4-chloro-1-naphthol)である。可溶性反応生成物を生成する最も一般的な基質は、TMB(二重機能基質)、ABTS(2,2'-azino-di [3-ethylbenzthiazoline] sulfonate)、およびOPD(o-phenylenediamine)である。TMBは高感度基質である。その反応速度が速いため、オンライン速度論的分析に理想的である。650nmの波長で測定可能な青色を生成する。TMBはまた、1Mリン酸で反応を停止することによって終点アッセイに使用することもできる。酸性化の際に、450nmで測定可能な黄色の反応生成物が形成される。ABTSは通用する基質と考えられている。TMBまたはOPDよりも感度は低いが、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのすべての基質に使用できる最も広い作用範囲を有する。ABTSの反応生成物は、405~410nmで測定可能な青緑色化合物である。その反応速度はエンドポイントアッセイに適しており、反応生成物の色または吸光度を変化させない1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で容易に停止することが可能である。かつてOPDはペルオキシダーゼの最も一般的な基質であった。TMBと比べ、わずかに敏感ではない。その反応生成物は黄色であり、490nmで読み取ることができる。化学反応は以下の通りである。

特性:一般的に使用される。 非常に簡単である。安価。APシステムよりも感度が低いまたは特異性が低い。