クロマチン免疫沈降/IP

必要な試薬

ビオチン標識抗体または非ビオチン標識抗体+抗IgGビオチン(ChIPに適したすべての抗体にはクリックしてください)
ビオチン標識正常IgG(陰性対照)
溶解緩衝液、希釈緩衝液、洗浄緩衝液、および免疫磁気ビーズ
37%ホルムアルデヒド溶液1Mグリシンロイペプチン
アプロチニン
フッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)
ストレプトアビジン磁性ビーズまたはアガロースビーズ
PCRキット
リン酸緩衝食塩水(PBS);
ジメチルスルホキシド(DMSO); 
DNA 精製キット 
脱イオン水または蒸留水
オプション:既知の標的遺伝子(PCRまたはqPCRで読み出す場合は陽性対照として使用される)のためのプライマー
ご注意:ExactaChIP クロマチン免疫沈降キットには一次抗体、コントロール抗体、溶解緩衝液、希釈緩衝液、洗浄緩衝液およびキレート樹脂溶液が含まれる。

材料

ピペットとピペットチップ
1.5mLマイクロ遠心チューブ
15 mL Falconチューブ
超音波装置
超音波浴
揺動装置
エッペンドルフ管回転装置
ベンチトップ超遠心分離機
冷蔵超遠心分離機
ベンチトップ遠心分離機
ウォーターバスとヒートブロック
PCRサーモサイクラー
磁気ビーズを使用する場合は、磁気分離器も必要です。

手順

最終濃度1%に希釈した37%ホルムアルデヒドで細胞をインキュベートし、室温で15分間振とう装置上で細胞とインキュベートすることにより、タンパク質-DNA複合体を架橋する。ホルムアルデヒドを、125mMの最終濃度に希釈した1Mグリシンを加えることによってクエンチする。室温で5分間ロックし、細胞を沈殿させ、培地を除去する(この時点で、サンプルは-70℃以下で一晩保存することができる)。
溶解緩衝液にプロテアーゼ阻害剤を添加する(10 μg/mLロイペプチン、10 μg/mLアプロチニンおよび1 mMのPMSF)。5×10 6細胞あたり500μLの溶解緩衝液に細胞沈殿物を再懸濁する。ピペットで上下に細胞を再懸濁させ、氷上で10分間インキュベートする(この段階からサンプルを氷上に保持する)。サンプルを超音波処理し、約1kbの平均長さにクロマチンをせん断する。(最適化が必要な場合がある;詳しくはテクニカルヒントのセクションを参照してください)。500μLの各サンプルを1.5 mLのマイクロ遠心チューブに移す。
冷蔵超遠心分離機を用いて12,000 x gで10分間溶解物を遠心分離する。上清をきれいなチューブに集め、沈殿物を捨てる。1 mLの希釈バッファー(ステップ3と同じ量のプロテアーゼインヒビターを含む)を加えて上清を希釈し、抗体または正常IgG 5μgをサンプルに添加する。超音波浴で15分間室温でインキュベートする(あるいは、抗原が低レベルの発現を有すると予想される場合は、回転装置で2℃〜8℃で一晩インキュベートする)。二次抗体(例えば、ロバ抗ヤギIgG-ビオチン)5μgを添加し、超音波浴中で室温で15分間インキュベートする(あるいは、回転装置で2〜8℃で1〜2時間インキュベートする)。ビオチン標識の一次抗体を用いる場合、二次抗体工程は不要である。
サンプルに50μLのストレプトアビジンビーズ(磁性またはアガロース)を加え、回転装置で2℃〜8℃で30分間回転させる。
磁気ビーズを使用する場合は、チューブを磁石に2分間放置してビーズを収集する。アガロースビーズを使用する場合は、12,000 x gで1分間遠心分離してビーズを集める。あらかじめ2〜8℃に冷却した洗浄バッファーで4回洗浄する。各洗浄の際に1mLの洗浄バッファーを加える。洗浄バッファー1から開始し、洗浄バッファー4で終了する。各洗浄の間にピペットで上下にビーズをブローし、ミックスする。
最後の洗浄の後、100μLのキレート樹脂溶液を直接ビーズに加え、約10秒間ピペットで上下にブローし、ミックスする。heat blockまたは温度制御された水浴を用いてサンプルを10分間沸騰させる。
室温で1分間12,000 x gで微量遠心分離し、上清(〜80μL)を清潔なマイクロ遠心チューブに移す。
120μLの脱イオン水または蒸留水をビーズに添加する。10秒間ピペットで上下にブローし、ミックスする。1分間遠心分離し、新しい上清を集め、ステップ10の上清とミックスしてください(この時点でサンプルは-20℃以下または-70℃以下で保存することができる)。
DNA精製キットを用いてDNA調製物を浄化し、濃縮する。50μLの脱イオン水または蒸留水にDNAを再懸濁する。このステップでは、DNAをより少量に濃縮し、PCR反応に影響を与える可能性のある不純物を最小限に抑えることによってPCRフラグメントの収量を増加させす(この時点でサンプルは-20℃以下または-70℃以下で保存することもできる)。
PCR反応で2〜10μLのDNAサンプルを使用してください(詳細はテクニカルヒントのセクションを参照してください)。

テクニカルヒント

固定

インキュベーションの持続時間およびホルムアルデヒドの最終濃度は、手順の効率に影響し得る。より短いインキュベーション(例えば、5分)は、せん断効率を改善することができるが、沈殿したDNAの収率に影響を及ぼし得る。

実験の条件

刺激時間および条件は、興味を持つ細胞の種類に応じて研究者によって決定および最適化されるべきである。

1キロベース断片を得るためのソニケーター設定

ソニケーターの設定は研究者により最適化すべきである。例えば、Heat Systems-Ultrasonicsソニケーターを4%の出力パワー、70%のデューティー、出力コントロール3、4ラウンドの15パルス(2秒パルス)、静止した状態に設定することによって、1キロベース(kb)の平均サイズのDNAを得ることができる。ラウンドの間にサンプルを氷水上で2分間置いて、サンプルを常に氷水に保つ。剪断効率を低下させる可能性があるので、発泡は避けるべきである。発泡は、超音波プローブの不適切な位置(表面に近すぎる、またはチューブの底に触れる)によって引き起こしうる。

DNA断片の平均サイズを決定するために、1〜2%(重量/容量)のアガロースゲル上でDNAマーカーと剪断したクロマチン(手順のステップ5の後)のアリコートを流す。ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、UV光下でDNAを観察する。

抗体のインキューベーション

ビオチン標識抗体を使用する場合、免疫沈降の効率を増加させるためにインキュベーション時間は2〜8℃で一晩に変えることができる。例えば、これは、限られた数の細胞の場合、または低い相対レベルで発現した抗原の場合に行うことができる。

対照

PCRの陽性対照として、免疫沈降前に試料から調製したDNA(全細胞溶解物)は全DNAまたは入力DNAとして使用することができる。

その他のコントロールについては、無関係の抗体、興味を持つタンパク質によって制御されないことが知られているプロモーターにアニールするように設計されたプライマー、または興味を持つタンパク質に結合しないことが知られている遺伝子の領域にアニールするように設計されたプライマーを使用してください。