ウェスタンブロッティングトラブルシューティングガイド: 複数のバンドが観察される

ウエスタンブロットアッセイは、目的のタンパク質を研究するための強力なツールです。 しかしながら、ウエスタンブロッティングに複数のバンドが観察される場合、これはタンパク質アッセイにおける困難およびトラブルを増加させる可能性があります。また、複数のバンドの原因を調べる必要があります。なぜなら、それらは技術的な人為的結果または目的のタンパク質の真の変化によって引き起こされる可能性があります。

下記のウェスタンブロッティングトラブルシューティングガイドは弊社の10年以上の経験に基づくもので、複数のバンドまたはバンドが多すぎるという問題を解決するのに役立ちます。

考えられる原因& 解決案

Multiple bands/too many bands  in a western blot

複数のバンドまたはバンドが多すぎます
考えられる原因 解決案
一次抗体または二次抗体の非特異的結合。 • 2%脱脂粉乳含有ブロッティングバッファーを起始点として使用して、一次抗体および二次抗体を希釈します。 必要に応じて抗体の濃度を調整します。
• 一次抗体または二次抗体溶液に0.1〜0.5%Tween 20を加えます。
• 抗体希釈および洗浄工程に使用するブロッティングバッファー中のNaCl濃度を増加させる(推奨範囲0.15 M - 0.5 M)。
• 洗浄工程に使用するブロッティングバッファー中のTween 20濃度を増加させます(0.1%〜0.5%)。洗浄工程の回数を増やします。
ゲルに過剰量のライセートがロードされた。 • 段階希釈のライセートを使用することは、最適なローディング量を決定するのに役立ちます。 洗濯サイクルを長くすることもこの問題を軽減できます。
低分子量生成物はタンパク質分解による可能性があります。 • 推奨されるプロトコルに従って細胞/組織を溶解することにより新鮮なサンプルを調製してください。 あなたの実験サンプルのシグナルをポジティブコントロールと比較してください。
翻訳後タンパク質修飾 • 高分子量産物は、グリコシル化、ミリスチル化、リン酸化、および/またはユビキチン化を含むがこれらに限定しない翻訳後タンパク質修飾の結果である可能性があります。
タンパク質凝集 • もっと高い分子量のバンドは、SDSおよび煮沸によっては分解できないタンパク質凝集の結果である可能性もあります。
タンパク質分解 • これは、特に試料が長期間保存した場合、または出発組織の均質化後にタンパク質や膜が分画されている場合は、珍しいことではありません。全ての追加のバンドは全長タンパク質よりも見かけ上の分子量が低いです。シナプシンおよびシナプトタグミンがとりわけ感受性です。PMSF、ペプスタチンまたはロイペプチンのようなプロテアーゼ阻害剤を添加することを考えるべきです。
非効率的ブロッキング • 非イオン性界面活性剤および/またはタンパク質を含む様々なブロッキング剤が文献に記載されています。ブロッキング条件を変えることで、この問題を改善する可能性があります。
抗原の濃度が低すぎます。 • SDS-PAGEの解像度は50〜100バンドに制限されています。目的の抗原の相対濃度が低すぎる場合(総タンパク質の0.2%未満)、検出しにくいかもしれません。例えば、シナプトブレビン/ VAMPは、細胞ホモジネート中のヒストンと一緒に共遊走し、これはその検出を妨害します。シグナルのエンハンスメントは人為バンドの出現を引き起こす可能性があります。分画または免疫沈降による抗原の濃縮を考慮すべきです。