ウエスタンブロット用の膜ブロッキング

ウェスタンブロット解析におけるブロッキングはなぜ重要ですか。ウェスタンブロットにおける膜ブロッキングの目的は膜と抗体(一次抗体および二次抗体の両方を含む)の非特異的結合を防止することで、さらにウエスタンブロットにおける高いバックグラウンドという共通の問題を避けることができます。

ウエスタンブロットの原理:

ウェスタンブロッティングブロッキングは、抗体が膜に非特異的に結合するのを防ぐことができるため、ウェスタンブロッティングにとって非常に重要なステップです。ブロッキングは通常、TBST/ PBST中で希釈したBSAまたは脱脂乳で行うことが多いです。これらの緩衝液に関しては、PBSはAPシグナルを妨害するので、TBSTはAP(アルカリホスファターゼ)標識抗体に好ましいことにご注意ください。

脱脂粉乳は、安価で広く入手できるので、通常は好ましい選択です。 しかし、牛乳タンパク質はすべての検出標識に適合しているわけではないため、適切なブロッキング溶液を選択することに十分な注意を払う必要があります。 例えば、BSAブロッキング溶液がビオチンおよびAP抗体標識および抗リンタンパク質抗体を有するため、通常は好ましい選択です。一方、牛乳はそれ自体がリン酸化タンパク質およびビオチンであるカゼインを含むため、アッセイ結果を妨害することになります。

Membrane blocking for Western Blot
ウエスタンブロット用の膜ブロッキング

ウェスタンブロットのブロッキングバッファーと時間

ブロッキングバッファー

3〜5%の脱脂乳またはBSA(ウシ血清アルブミン)含有1X TBST または 1X PBST はウェスタンブロットにおけるブロッキングバッファーとして使われます。しかし、脱脂乳とBSAの長所と短所はそれぞれ何ですか?

ブロッキング剤としての脱脂乳 VS BSA

  メリット デメリット
脱脂乳 • BSAより安価
• すぐに利用でき、粉で調製すること容易です。
• リン酸化タンパク質の検出には使用すべきではありません。
• ミルクはビオチンを含んでいるため、アビジン - ビオチン検出システムの場合は使用すべきではありません。
• 膜に結合する微粒子を除去するためにろ過が必要です。
BSA • 一般的なブロッキング剤です。
• もっと明確な結果が得られます。それは一種のタンパク質しか含まないため、抗体と交差反応しません。
• アルブミンは分泌タンパク質で、リン酸化されない傾向があるため、リン酸化抗体と併用すると効果的です。
• ミルクより高価
• 微粒子を除去するためにろ過が必要です。
• バックグラウンドを高めることができる炭水化物を含んでいるため、レクチンプローブと互換性がありません。

ブロッキングの方法

4℃で、膜ブロッキング溶液中で1時間または1時間以上、撹拌しながらインキュベートします。インキュベーションの後、膜をTBST中で5秒間すすぎます。