ウエスタンブロット用のポリアクリルアミドゲル電気泳動

ウエスタンブロットは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)、膜(大部分はPVDFまたはニトロセルロース)への電気泳動転写、および免疫染色という三つの部分からなります。免疫染色により、ブロット膜上の特定のタンパク質を可視化することができます。SDS-PAGEは、分子量によってタンパク質を分離するための標準的な手段です。この技術には一次元電気泳動と二次元電気泳動が含まれます。一次元ゲル電気泳動はほとんどの日常的なタンパク質の分離に使用されており、ここでは主にこの技術について説明します。

ウエスタンブロット用のPAGEゲルの調製

SDS-PAGEのステップ1はゲルの調製です。SDS-PAGEゲル処方は以下のように提供され、異なるパーセンテージのSDS-PAGE分離ゲルおよび濃縮ゲルを含みます。

経験則:

• 標的タンパク質のサイズが小さければ小さいほど、分離ゲルの百分率は高くなります。標的タンパク質のサイズが大きければ大きいほど、分離ゲルの百分率は低くなります。
• TEMEDとAPを加えたら、ゲルはかなり迅速に重合するので、注ぎ込む準備ができるまでにこれを加えないでください。

ウェスタンブロット分離ゲル溶液のレシピ

ゲル (%) H2O (mL) 30% アクリルアミド/ビス-アクリルアミド(mL) 1.5 M Tris-HCl,
pH 8.8 (mL)
20% SDS (mL)* 10% APS (mL)* TEMED (mL)*
7 15.3 6.9 7.5 0.15 0.15 0.02
10 12.3 9.9 7.5 0.15 0.15 0.02
12 10.2 12.0 7.5 0.15 0.15 0.02
13 7.2 15.0 7.5 0.15 0.15 0.02

ウェスタンブロット濃縮ゲル溶液(4%アクリルアミド)のレシピ

ゲル (%) H2O (mL) 30% アクリルアミド/ビス-アクリルアミド(mL) 1.5 M Tris-HCl,
pH 8.8 (mL)
20% SDS (mL)* 10% APS (mL)* TEMED (mL)*
4 0.67 6.9 1.25 0.025 0.025 0.005
*, SDS: ラウリル硫酸ナトリウム; APS: 過硫酸アンモニウム; TEMED: テトラメチルエチレンジアミン.

異なる種類のポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)

実験条件によって、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)はネイティブPAGEとSDS-PAGEに分けられます。 ほとんどの一般的ウエスタンブロッティングでは、タンパク質を完全に変性させ、すべての高次構造を除去するために、SDSと還元剤も添加されています。

PAGEの種類 ゲルの条件 SDS* DTT または ß-ME* 注意
ネイティブ PAGE ネイティブ - - タンパク質の高次構造を維持します。
SDS-PAGE 変性および還元 + + ジスルフィド結合を含くんで、タンパク質のすべての高次構造を除去します。
*, SDS: ドデシル硫酸ナトリウム; DTT: ジチオスレイトール; ß-ME: β-メルカプトエタノール

ウエスタンブロット用の陽性コントロール

一般に、陽性コントロールは標的タンパク質の発現を示す細胞株または組織試料です。 精製組換えタンパク質も陽性コントロールとして使うことができます。陽性コントロールは、ウエスタンブロットプロトコールに問題がないことを証明するために使用されるのです。したがって、陽性コントロールライセートから陽性シグナルが得られない場合は、プロトコールを最適化する必要があります。

弊社の「細胞ライセート」ページをご覧になり、あなたの実験に適した陽性対照を選んでください。

ウエスタンブロット用の陰性コントロール

陰性組織コントロールは、非特異的結合や偽陽性結果を明らかにするために、対象タンパク質を発現しないことがわかっている組織を選択します。

陰性コントロールとして、ノックダウン(KD)やノックアウト(KO)組織 / 細胞株を使用することが一般的です。

ウエスタンブロット用のローディングコントロール

ローディングコントロール抗体は、ウエスタンブロット中にゲルを均等にロードするためのツールとして使用され、ウエスタンブロットの結果を定性的または定量的に比較するときにも役立ちます。 ローディングコントロール抗体はローディングコントロールに対するものです。それは通常、ハウスキーピング遺伝子にコードされ、多くの細胞株や組織で高レベルで安定して発現します。一般的なローディングコントロール抗体には、アクチン、ベータアクチン、COX IV、GAPDH、ヒストンH3、アルファチューブリンおよびベータチューブリンなどが含まれます。

Sino Biologicalは分子量16 kDa〜75 kDaの信頼性の高いローディングコントロール抗体を提供し、全細胞タンパク質、細胞質タンパク質、ミトコンドリアタンパク質および核タンパク質の検出に使用することができます。また、血清サンプル中のローディングコントロールとして使用できるトランスフェリン抗体も提供しております。

詳細については「ウエスタンブロッティング用のローディングコントロール抗体」ページをご覧ください。