ウエスタンブロットにおける一次抗体インキュベーション

ブロッキングの後、続いてウエスタンブロット膜を一次抗体と共にインキュベートします – 標的タンパク質を認識します。 ウエスタンブロット用の一次抗体の選択は、検出する抗原およびその抗原に対して利用可能な抗体に依存します。 あるいは、目的の抗原を認識するために一次抗体を作製すべきです。モノクローナル抗体もポリクローナル抗体もウエスタンブロッティングに適しています。モノクローナル抗体はそれらの特異性、純度および一貫性のために、高く評価され、より低いバックグラウンドをもたらします。 ポリクローナル抗体は、より安価で時間がかからず、そして通常、抗原に対して高い親和性を有します。 血清または腹水液および他の粗抗体調製物はウエスタンブロッティングに使用されますが、存在する不純物はバックグラウンドを増加させる可能性があります。 最大の特異性を有する抗体を得るために、固定化抗原を用いてそれらをアフィニティー精製することができます。

ウエスタンブロット一次抗体は、モノクローナル抗体(MAb)とポリクローナル抗体(PAb)の両方を含みます。 ウエスタンブロットでは、目的に応じて、さまざまな種類の一次抗体を選択できます。弊社は様々な一次抗体を提供しております。

Western Blotting primary antibodies incubation
ウエスタンブロットにおける一次抗体インキュベーション

ウエスタンブロットにおける一次抗体インキュベーションのヒント

以下は一次抗体インキュベーションに関するヒントで、ウエスタンブロッティングの問題を解決するのに役立つかもしれません。 また、ウエスタンブロッティングに問題がある場合は、遠慮なく support@sinobiological.comまでお問い合わせください。

ウエスタンブロットにおける一次抗体の目的は何ですか?

抗体は、ウエスタンブロット法の成功にとって重要です。 間接検出法では、一次抗体で目的のタンパク質に特異的に結合し、次いで標識二次抗体で検出します。 直接検出法により、蛍光色素または酵素で一次抗体を標識し、そして目的のタンパク質の結合と検出の両方に関与します。

ウエスタンブロットで一次抗体をどのくらいインキュベートしますか?

それは、抗体と標的タンパク質の結合親和性に依存し、通常は室温で2時間または4℃で一晩インキュベートします。
一次抗体と共にインキュベートした後、次いで膜をTBSTまたはPBST緩衝液で4-5回、各回約5分間、撹拌しながら洗浄して、残っている未結合の一次抗体を除去します。

一次抗体インキュベーション時間が長すぎます?

場合によります。 通常、一次抗体のインキュベーション時間を長くすることができますが、それは非特異的なバンドと高いバックグラウンドを引き起こします。 しかしながら、時には、希釈度の高い抗体を使用することや、撹拌しながらもっと長くインキュベートすることによって、特異的結合、そして膜を十分で均質に被覆することを確保することができます。

ウエスタンブロットにおける一次抗体希釈バッファーのレシピは?

1X TBS, 0.1% Tween-20 と 5% BSA; 20 mlの場合、2 ml 10X TBSを18 mlの水に添加し、混合します。1.0 g BSAを添加し、よく混ぜます。撹拌しながら、20 μl Tween-20 (100%)を添加します。

ウエスタンブロットを行うために一次抗体はどのように希釈しますか?

製造元のデータシートに従って、一次抗体を新鮮なブロッキングバッファーで推奨される希釈度/濃度に希釈し、最適な作業濃度を決定します。 たとえば、製品データシートでウエスタンブロッティングに1:1000希釈液を使用することが推奨されている場合は、1:250、1:500、1:1000、1:2000、1:4000の段階希釈を行うことをお勧めします。これにより、個々のサンプル条件に最適な希釈率が決まります。

Tween-20を含むブロッキング緩衝液は疎水性相互作用をブロックすることができます。それがなければ、ランダムで非特異的な結合を得るかもしれません。 他の実験室ではブロッキング緩衝液の代わりにTBSTを使用しています。 結果は抗体によって異なります。