ウエスタンブロットにおける二次抗体インキュベーション

最も広く使用されているウエスタンブロット法 - 間接検出法では、一次抗体のインキュベーション後に、ウエスタンブロットで一次抗体を認識する二次抗体をインキュベートします。弊社は WB、ELISA、IP、IF / ICC、IHCなどの適用に使用できるさまざまな 二次抗体をご用意しております。

二次抗体インキュベーションのヒント

以下は二次抗体インキュベーションに関するヒントで、ウエスタンブロッティングの問題を解決するのに役立つかもしれません。 また、ウエスタンブロッティングに問題がある場合は、遠慮なく support@sinobiological.comまでお問い合わせください。

ウエスタンブロットにおける二次抗体の目的は何ですか?

間接検出法では、二次抗体は一次抗体が目的のタンパク質を検出するのを補助します。二次抗体は一般に蛍光染料または酵素で標識されています。一次抗体は直接検出で標識されています。

ウエスタンブロット検出に使用できる標識二次抗体は様々です。二次抗体の選択は、一次抗体を産生する動物の種(宿主種)に依存します。 例えば、一次抗体がマウスモノクローナル抗体である場合、二次抗体はマウス以外の宿主から得られた抗マウス抗体でなければなりません。

ウエスタンブロットで二次抗体とインキュベートする時間は?

通常、攪拌しながら、室温で1〜2時間または4℃で一晩
二次抗体と共にインキュベートした後、次いで膜をTBST またはPBST緩衝液で4〜5回、各回約5分間撹拌しながら洗浄して、残っている未結合の二次抗体を除去します。

ウエスタンブロットで一次抗体インキュベーションを一晩行っても大丈夫ですか?

二次抗体と共に1時間インキュベートするのは、ウエスタンブロッティングで普遍的に使用される標準的なプロトコルです。 一般的な考えとは対照的に、一次抗体と二次抗体との間の相互作用は必ずしも容易かつ迅速というわけではありません。場合によっては、48時間のインキュベーション後でもプラトー検出限界に達しず、GAPDHがプラトーに達するには16時間のインキュベーションが必要です。また、インキュベーション時間の増加によるバックグラウンドの増加は観察されていません。

ウエスタンブロットにおける二次抗体希釈バッファーのレシピは?

1X TBS, 0.1% Tween-20 と 5% BSA; 20 mlの場合、2 ml 10X TBSを18 mlの水に添加し、混合します。1.0 g BSAを添加し、よく混ぜます。撹拌しながら、20 μl Tween-20 (100%)を添加します。

ウエスタンブロットでは二次抗体を作用濃度にどのように希釈しますか?

製造元のデータシートを参照して、推奨されている希釈率に従って 一連の希釈系列を試してください。 次に、結果に基づいて希釈率を最適化します。