ウエスタンブロット用のタンパク質転写膜

ウエスタンブロットでは、適切なメンブレンを選択することがタンパク質転写手順の成功にとって重要です。 膜は種類や製造元によって異なる場合があり、ユーザーは一般に、用途に最も適した膜を決定するために、広告および膜特性に関する概括に頼らなければなりません。 アッセイにおける膜の性能は、結合するタンパク質の性質、タンパク質還元に使用される緩衝液、タンパク質を保持する膜の能力、他のタンパク質およびリガンドが膜への非特異的結合(これは望ましくないバックグラウンドをもたらす可能性があります)、膜がそれに提示されるタンパク質に結合する速度(未発表の観察)に関与します。

これらすべての要素を考慮すると、以下は3種類の膜、すなわちPVDF、ニトロセルロースおよびナイロンの特徴を対比しています。あなたにこれらの膜の機能を全面的に理解し、あなたのウエスタンブロットに適した膜を選ぶのを助けるのを願っています。

ウエスタンブロットに用いられる適切なタンパク質転写膜の選択

  PVDF

ニトロセルロース

ナイロン

タンパク質のサイズ 高分子量タンパク質に適する

低~中分子量のタンパク質に適する

核酸に適する

結合能 100 - 200 µg/cm2 80 - 100 µg/cm2 > 400 µg/cm2
バックグラウンド やや低い 非常に低い 高い
ストリップ&リプローブ よく機能する 可能、しかし感度を失う可能性がある よく機能する
物理的強度 乾いたら脆い
耐溶剤性
前処理 メタノールで湿らせる バッファーで湿らせる バッファーで湿らせる
孔径 0.2 μm, 0.45 μm 0.2 μm, 0.45 μm 0.45 μm
適用* WB, SB, NB, PS, AA WB, SB, NB, AA WB, SB, NB
* WB: ウエスタンブロット; SB: サザンブロッティング; NB: ノーザンブロッティング; PS: タンパク質配列決定; AA: アミノ酸分析.

PVDF 転写膜

PVDF(ポリフッ化ビニリデン)膜は高強度で、タンパク質が膜に結合するメカニズムは、疎水性相互作用によるものです。転写前にPVDF膜をメタノールで濡らすと、タンパク質の結合を増加させることができることが示されています。ニトロセルロースメンブレンと比べ、タンパク質はPVDFメンブレンに強く結合します。強固な結合により、洗浄工程中にタンパク質を保持するのを助けます。PVDFは低タンパク質結合膜の1つであると考えられています。

ニトロセルロース 転写膜

1967年にタンパク質ブロッティングに使用するために導入されたニトロセルロースメンブレンは、現在最も一般的に使用されているブロッティングメンブレンの1つです。 ニトロセルロース膜がタンパク質に結合するメカニズムは、おそらく疎水性相互作用、高塩濃度および低メタノール濃度によるもので、電気泳動転写中のタンパク質の膜への固定化を改善します。ニトロセルロースメンブレンを使用する主な利点は、バックグラウンドが非常に低いことです。しかしながら、ニトロセルロース膜は機械的強度が低く、乾燥すると脆くなり取り扱いが困難になります。これは、ウエスタンブロット実験における多重ストリッピングおよびリプローブへの使用を制限します。

ナイロン 転写膜

ナイロン(ポリアミド)メンブレンは、未変性または正電荷を帯びたバイオダインAおよびバイオダインBナイロンで構成されています。この膜がタンパク質と核酸に結合するメカニズムは、イオン性、静電性および疎水性相互作用です。ナイロンメンブレンは高い機械的強度を持ち、これはストリッピングおよび再プローブ手順を必要とするウエスタンブロット実験において利点を提供します。ナイロンメンブレンは、ニトロセルロースメンブレンよりも常に高効率のタンパク質転写SDSゲルを提供します。しかしながら、ナイロンメンブレンは1つの大きな欠点があります。即ち、それらがクマシーブリリアントブルーおよびアミドブラックのような一般的なアニオン染料を結合し、それがバックグラウンド染色をもたらし、転写タンパク質の検出を不明瞭にする可能性があります。