免疫磁気ビーズ IPプロトコール

プロトコール (プロテイン A/G/L)

このプロトコール(Fig. 1)では50 μLの免疫磁気ビーズプロテイン Aを使用しましたが、必要に応じて増加または減少することができます。

細胞溶解

細胞は、出発物質に従って任意の標準的な細胞溶解プロトコールを用いて溶解することができますが、NP40細胞溶解緩衝液(キットに同梱)を使用することを推奨します。

ビーズの準備

1.バイアルに免疫磁気ビーズを再懸濁する(30秒以上ボルテックスするか、または傾けて5分間回転させる)。
2. 50μLの免疫磁気ビーズをチューブに移す。
3.チューブを磁気分離器の上に置き、免疫磁気ビーズを溶液から分離し、上清を除去する。
4.磁気分離器からチューブを取り外す。

抗体との結合

1. 200μLのPBSTで抗体(通常1〜10μg)を希釈し、免疫磁気ビーズに加えます。 使用する抗体の量は最適化する必要があります。
2.室温で10分間回転させながらインキュベートします。
3.チューブを磁気分離器の上に置き、上清を除去します。
4.チューブを磁気分離器から取り出し、軽いピペッティングにより200μLのPBSTを用いて免疫磁気ビーズを洗浄します。抗体を結合した免疫磁気ビーズの保存には、凝集を防ぐためにPBSTを使用することを推奨します。

標的抗原の免疫沈降

1.チューブ(抗体との結合もステップ5から)を磁気分離器に置き、上清を取り除きます。
2. チューブにサンプル(典型的には100-1,000μL)を加え、軽いピペッティングによって免疫磁気ビーズ - 抗体複合体を軽く混合します。
3. 室温で10分間回転させながらインキュベートし、抗原を免疫磁気ビーズ - 抗体複合体に結合させます。
注意:最適な結合のためにインキュベーション時間を長くする必要があるかもしれません。
4.必要に応じて、チューブを磁気分離器に置き、上清を除去するか、上清を清潔なチューブに移してさらに分析します。
5.各洗浄には200μLのPBSを用いて免疫磁気ビーズ - 抗体 - 抗原複合体を3回洗浄します。各洗浄の間に磁気分離器で分離し、上清を除去し、穏やかなピペッティングによって複合体を再懸濁します。
6.上記の複合体を100μLのPBSに再懸濁し、免疫磁気ビーズ懸濁液をきれいなチューブに移します。これは、チューブ壁に結合したタンパク質の同時溶出を避けるために推奨されます。

標的抗原の溶出

A. 変性溶出
1.チューブ(標的抗原の免疫沈降のステップ6から)を磁気分離器に置き、上清を除去します。
2. 20μLの溶出バッファーと5μLの5×SDS-PAGEサンプルバッファーを加え、免疫磁気ビーズ複合体を穏やかなピペッティングで再懸濁します。
3. 95-100 ℃で5-10分間加熱します。
4.チューブを磁気分離器の上に置き、上清を回収し、さらなる分析に用います。
B.温和な溶出
1.チューブ(標的抗原の免疫沈降のステップ6から)を磁気分離器に置き、上清を除去します。
2. 20μLの溶出バッファーを加え、穏やかなピペッティングで複合体を再懸濁します。 発泡を避けてください。
3.室温で2分間回転させながらインキュベートし、複合体を解離させます。
4.チューブを磁気分離器に置き、溶出した抗体と抗原を含む上清をきれいなチューブに移します。 溶出したタンパク質は機能的アッセイに使用するか、または保存する場合、溶出液のpHは、中和バッファーを添加することによって調整することができます。

標的抗原の検出

A. 変性溶出
1. 染色およびタンパク質同定用SDS-PAGE 
2. ウエスタンブロッティング用SDS-PAGE 
3. 蛍光光度分析用SDS-PAGE 

B. マイルドな溶出
1. タンパク質特性評価
2. 免疫化
3. 酵素研究
4. AA配列決定
5. 結晶化

C. 溶出なし
1.タンパク質相互作用
2.酵素研究
3.バイオアッセイ
4.イムノアッセイ

Protocol(For tagged protein)

The protocol (Fig. 1) uses 50 μL FLAG Tag Immunomagnetic Beads, but this can be scaled up or down as required.
Cell Lysis
Cells may be lysed using any standard cell lysis protocol in accordance with your starting materials. We suggest using NP40 Cell Lysis Buffer (supplied with kit).
Immunoprecipitate Target Antigen
1. Add 50 μL of Immunomagnetic Beads into a 1.5 mL microcentrifuge tube.
2. Add 150 μL of 1× TBST buffer to the Immunomagnetic Beads and gently vortex to mix.
3. Place the tube into a Magnetic Separator to collect the Immunomagnetic Beads against the side wall of the tube. Remove and discard the supernatant.
4. Add 1 mL of 1×TBST buffer to the tube. Invert the tube several times or gently vortex to mix for 1 min. Collect the Immunomagnetic Beads with a Magnetic Separator. Remove and discard the supernatant.
5. Add the sample containing target protein (~100 μg of protein in 100 μL) to the pre-washed Immunomagnetic Beads, add 400 μL of 1×TBST buffer and incubate at room temperature for 30 min with mixing.
6. Collect the Immunomagnetic Beads with a Magnetic Separator , remove the unbounded sample and save for analysis.
7. Add 300 μL of 5× TBST buffer to the tube and gently mix. Collect the Immunomagnetic Beads and discard the supernatant. Repeat this wash twice.
8. Add 300 μL of ddH2O to the tube and gently mix. Collect the Beads on a Magnetic Separator and discard the supernatant.
Elute Target Antigen
A. Neutral Elution Protocol
1. Prepare DYKDDDK peptide (PP101274) at 1mg/mL in PBS
2. Add 50 μL 1mg/mL DYKDDDK peptide to the Immunomagnetic Beads, gently vortex to mix and incubate the sample at 37 oC on a rotator for 5-10 min. Elution may be performed at reduced temperatures, but lower yields may result.
3. Separate the Immunomagnetic beads on a Magnetic Separator and save the supernatant containing the target antigen.
4. Repeat Elution step once for higher recovery.
B. Alkaline Elution Protocol
1. Add 100 μL of Alkaline Elution Buffer to the tube.
2. Gently vortex to mix and incubate the sample at room temperature on a rotator for 5 min.
3. Magnetically separate the Immunomagnetic Beads and save the supernatant containing the target antigen.
4. To neutralize the sample, add 50 μL of Neutralization Buffer for each 100 μL of eluate.
C. Acidity Elution Protocol
1. Add 100 μL Acidity Elution Buffer.
2. Gently vortex to mix and incubate the sample at room temperature on a rotator for 5-10 min.
3. Magnetically separate the Immunomagnetic Beads and save the supernatant containing the target antigen.
4. To neutralize the low pH, add 15 μL of Neutralization Buffer for each 100 μL of eluate.
D. Elution Using Sample Buffer
1. Add 100 μL of SDS-PAGE Sample Buffer to the tube.
2. Gently vortex to mix and incubate the sample at 95-100⁰C for 5-10 min.
3. Magnetically separate the Immunomagnetic Beads and save the supernatant containing the antigen.