免疫沈降/IP-IP抗体 & 細胞ライセートの使用方法

問題と解決案

A.免疫沈降したサンプルでウエスタンブロットを行う際は、より多くの一次抗体またはより少ない一次抗体を使用する必要がありますか?

ウエスタンブロットで免疫沈降したサンプルを探る場合、一次抗体の濃度を高めることにより感度を高めることができます。 しかし、最良の結果を得るためには、経験によって抗体の最適希釈率を決定すべきです。

B.どのくらいの抗体とどのくらいのサンプルを使用すべきですか?

通常、サンプル当たり10-500μgの細胞ライセートと推奨抗体量を使用することを推奨します。これらの量は標的タンパク質の存在量およびタンパク質に対する抗体の親和性に応じて選択するほうがいいです。一般的に、プレ実験において一定量のタンパク質が増加する量の抗体によって沈殿されます。
IP抗体のデータシートで抗体の推奨濃度を確認することができます。 ガイドラインとして次を使用してください。
1~5 μl ポリクローナル抗血清
1μg親和性精製ポリクローナル抗体
0.2~1μl腹水(モノクローナル抗体)
20~100μl培養上清(モノクローナル抗体)

C. ライセートに多すぎる細胞/タンパク質が存在するため、溶出液中に多くの非特異的タンパク質をもたらします。

使用する細胞の数/ライセートの量を減らす。 一般に10〜500μgの細胞ライセートを使用すれば十分です。
また、ヤギ血清または正常ヤギIgGでブロックすることもできます。

D.抗体が多すぎたため、非特異的結合をもたらしました。

抗体の推奨量を確認してください。 最良の標的バンドを得るために勾配によって抗体を減少させることを試みてください。