免疫沈降/IPのコツ

細胞溶解:

組織または細胞培養からの細胞ライセートは直接的にウェスタンブロッティングに使用できる。サンプルが手順中に変性するため、実験結果を妨害しないために厳しい溶解条件(例えば、SDS-サンプルローディングバッファー)が必要である。 IP/co-IPの場合、溶解は、抗体 - 抗原結合に影響を与えないように比較的温和でなければならないが、細胞からタンパク質を効率的に抽出するのに十分厳しいものでなければならない。 膜タンパク質については、完璧な溶解プロトコールを見つけることは特に難しいかもしれない。

Pre-Clearing:

完全に不活性の免疫磁気ビーズは存在しない。試料が複雑になればなるほど、バックグラウンド結合がより起こり得る。

pre-clearing工程は、磁気ビーズへの試料成分の付着に起因するバックグラウンドを減少させることができる。非常に良い理由なしにはこの手順は行うべきではない。 なぜなら、pre-clearing工程は、抗体と抗原との間の結合を妨害するからである。

結合:

結合ステップの考え方は、免疫磁気ビーズと抗原(タンパク質)の三元複合体を形成することである。この工程(ならびに洗浄工程)で使用される緩衝液は、成功のための重要な要素である。これら3つの成分の添加順序も重要である。 抗体を磁気ビーズに予め結合させ、次いで、ライセートを固定化された抗体に添加する。

あるいは、(非固定化された)抗体をライセートとともにインキュベートして、溶液での中に抗体 - 抗原複合体を形成させる。次に、固定化プロテインAまたはG免疫磁気ビーズを添加して、抗体 - 抗原複合体を混合物から精製する。どちらのプロトコールがあなたの特定の免疫沈降システムで最良の結果を得るかについて二つのプロトコールを比較してください。

洗浄バッファー:

理想的には、洗浄は、抗体と抗原(およびco-IPのための抗原と結合パートナー)との特異的相互作用を維持しながら、非特異的な相互作用をすべて除去する。追加の溶解バッファーで洗浄するのは有用であり、なぜならそれには非特異的相互作用を壊すのを助けることができる温和な変性剤が含まれるからである。

バックグラウンドが問題である場合、洗浄緩衝液のストリンジェンシーを増加させることにより、試料からより精製された抗原および抗原抗体複合体を得ることができる。

溶出:

通常、非常に厳しい条件で完成される。例えば、還元SDSサンプルローディングバッファーの中でビーズを沸騰させる。固定化された抗体を使用する場合、抗体の干渉を避けるために温和な溶出(pH-shift)を使用してください。この場合、抗原(co-IPのための抗原および結合パートナー)のみが溶出され、抗体汚染がない。

検出:

典型的にはウェスタンブロッティングによって検出する。co-IP実験では、通常、非常に少量のタンパク質で検出するので、高感度のウェスタンブロッティング基質(ECLなど)が必要である。 

IPバッファーにあるライセートーーポジティブコントロールにより、サンプルに目的のタンパク質が含まれていることを確認してください。検出できない場合、サンプルに目的のタンパク質が含まれていない可能性がある。しかし、バンドがモノマーのサイズで見えない場合、タンパク質の二量体化/多量体化の可能性を考えてください。

磁気ビーズを洗浄して得られた液体ーー抗原または結合パートナーが免疫磁気ビーズに結合しているかどうかを確認してください。 洗浄工程1 – 洗浄バッファーが過度に厳しいかどうかをチェックしてください。

溶出後磁気ビーズを沸騰させる液体ーー溶出の効率を確認するために還元SDS-サンプルローディングバッファーの中で溶出した後、ビーズを沸騰させてください。

CHIPのこつ インビボクロスリンク:

いくつかの研究者は、ChIP実験において温和なインビボクロスリンク処理がどのように優れた結果をもたらすかを提出している。

例えば、長さゼロのリンカーであるphoto-amino acidは、co-IP開始前に結合を捕捉するための優れた方法である。

抗体の代わりに(組換え)餌タンパク質を使用してpreyタンパク質に結合させることが可能な場合、標識トランスファーメンブレン法は貴重な代替方法であり、またはco-IPの確認法として作用することができる。

プロテイン A/G/Lブロッキング:

プロテインAおよびプロテインG免疫磁気ビーズのブロッキングは、室温または4℃で、1-4%BSAで1時間(または1〜5%魚由来のゼラチン)実施されることが多い。
外来タンパク質(後の分析を妨害するかもしれない)を導入することなく、プロテインA/G/L免疫磁気ビーズを効果的にブロックする方法は以下の通りである。
プロテインA免疫磁気ビーズ:室温で一晩処理された50 mM Tris、200 mM glycine、1% Tween®-20、pH 10,6 
プロテインG免疫磁気ビーズ:4°Cで一晩処理された 50 mM Tris、200 mM ethanolamine、1% Tween-20、pH 10,6 
プロテインL免疫磁気ビーズ:4°Cで一晩処理された50 mM Tris、200 mM ethanolamine、1% Tween-20、pH 10,6