免疫沈降/IP-標的タンパク質が検出できません

問題と解決案

1. 免疫沈降中の抗原分解

細胞や組織を溶解する際、新鮮なプロテアーゼ阻害剤が添加されていることを確認してください。

2. 溶出された標的タンパク質が検出できません。

標的タンパク質は使用される試料の中で発現しないかまたは発現のレベルが低い可能性があります。
標的タンパク質の発現プロファイルを調べて、それがサンプルの細胞で発現することを確認してください。標的タンパク質の発現レベルが低い場合、使用される溶解物の量を増加させましょう。しかしながら、これは非特異的結合の増加をもたらす可能性があるので、IP手順の前にライセートをあらかじめクリアすることを提案します。

3. 標的タンパク質を捕捉するための抗体が不十分です。

推奨される抗体量が使用されていることを確認してください。結果の最適化のために抗体の濃度は増加する必要があります。

4.標的タンパク質はビーズから溶出されていません。

正しい溶出バッファーを使用していることを確認してください。また、その強度とpHが標的タンパク質の溶出に適することも確認してください。

5. 抗体は免疫吸着ビーズに結合していません。

使用している抗体アイソタイプの正しい免疫磁気ビーズを使用していることを確認してください。

6. 間違った溶解バッファーを使いました。

IP抗体のデータシートをチェックして、抗体が変性タンパク質またはネイティブタンパク質を検出したかどうかを確認してください。そして、正しい溶解バッファーを使用していることを確認してください。

7. 選択した抗体の結合が弱いようです。結合を改善するために何ができますか?

a. ELISAなどであなたの抗原に対するあなたの抗体の結合能力/特異性を確認しましょう。
b. ビーズに結合したIP抗体の結合をチェックしてください。抗体が捕捉されないか、または抗原に結合しない場合、免疫沈降実験は機能しません。
c. 間接法を使用している場合は、直接法を試してください。逆に、直接法を使用した場合は、間接法を試してください。
d. ビーズの数量とサンプル量を確認してください。データシートで提案されている異なるビーズの容量を参照して、IP手順の間、ビーズの数量または抗体の濃度を増加させましょう。
e. インキュベートの時間を増やしましょう。
f. ほかの抗体を試しましょう。

8. この前免疫磁気ビーズを使用してタンパク質を免疫沈降することができましたが、抗体をビーズに架橋させた後、ゲル上にタンパク質バンドは得られなくなりました。

あなたの抗体の結合部位は、おそらく架橋によって変えられました。このような状況が起こる際、あなたの抗体は、その標的抗原に対する親和性が低下したかまたは親和性がなくなりました。
これは架橋によくある問題ですが、Sino Biologicalの一次抗体標識免疫磁気ビーズで容易に回避できます。架橋のもう一つの結果は、予定外(非特異的)標的に対する親和性の増加です。

9. 私は免疫沈降操作を行う前に非架橋抗体を除去したが、依然としてゲルに抗体が免疫磁気ビーズから脱離することを示すバンドがありました。

ゲルローディングの前にサンプルバッファーに還元剤を使用している場合は、還元剤を含めないサンプルバッファーを試してみてください。
DTTまたはβ-mercaptoethanolなどの還元剤は、抗体内のジスルフィド結合を破壊し、抗体軽鎖および重鎖の放出をもたらします。
もう一つの方法は、pHを下げることによって、またはポリペプチド溶液によってタンパク質を溶出することです。これによりゲル中の非抗体バンドを示すことができます。