免疫沈降標識抗体

抗原-抗体免疫反応を顕微鏡で見るためには、抗体は酵素、フルオロフォア、コロイド金またはビオチンで標識しなければならない。酵素標識は、発色反応を介して酵素組織化学的方法によって光学顕微鏡で観察することができる。フルオロフォア標識は、蛍光顕微鏡で直接観察することができる。電子顕微鏡では、コロイド金のような高電子密度の標識がそれ以上の処理なしに見える。ビオチン標識は、ABC技術と組み合わせて、光学、蛍光および電子顕微鏡で観察することができる。ビオチンと同様に、ジゴキシゲニン(DIG)またはジニトロフェノール(DNP)などのいくつかの他のハプテンも、抗体に結合させることができる。それらの可視化については、酵素またはフルオロフォア標識の二次抗体が手頃な価格がある。

適切な基特異的試薬を用いて、抗体上の様々な官能基を介して、抗体に化学的に標識を導入することができる。多くのフルオロフォアは反応基を有し、反応基によりアルカリ性溶液(pH 9-10)中で抗体と共有結合しやすくなる。酵素で標識するには、グルタルアルデヒドのような追加の大きな分子で酵素を抗体に架橋する必要がある。
最も広く適用される原理は、N-hydroxysuccinimide esters(NHS-ES)を介したアミノ基のハプテン化である。便利なタンパク質標識手順のために、多くのハプテン(種々のフルオロフォア、酵素、ビオチン、DIGなど)が、現在、活性化NHS-ESとして様々なベンダーから購入できる。

免疫標識用抗体の製造には2つの複雑な工程がある。一つは目的の抗原に特異的に結合する抗体を産生することで、もう一つはタグを抗体に融合させることである。考えられるすべての抗原特異的抗体にタグを融合させることは実用的ではないので、ほとんどの免疫標識プロセスでは間接的な検出方法が使用される。この間接的方法は、抗原特異的である一次抗体および一次抗体に特異的に結合するタグに融合された二次抗体が使用され、棚から購入できる二次抗体の大量生産を可能にした。この間接的な方法に従って、一次抗体を試験システムに加える。一次抗体は標的抗原を探索し、結合する。その後、一次抗体に排他的に結合するように設計されているタグ付き二次抗体を添加する。

典型的なタグには、蛍光化合物、金ビーズ、特定のエピトープタグ、または着色化合物を産生する酵素が含まれる。抗体を介してタグを標的に結合させることによって、細胞膜、細胞質または核膜のような組織内のその固有の位置における目的の抗原の同定および視覚化を可能にした。特定の条件下で、この方法は、定量的な情報を提供することができる。

免疫標識は、薬理学、分子生物学、生化学、およびその他の分野で使用することができる。その中で最も重要なのは抗体結合可能な分子の正確な位置を知ることである。