免疫組織化学的方法

免疫組織化学に用いる酵素的方法は、塩化カルシウム、水酸化ナトリウム、塩酸溶液、脱ロウ用キシレン、およびメタノールのような試薬を使用します。免疫組織化学法は、一段階直接法、ABC法、二段階間接法およびTyramideシグナル増幅などの異なる染色手順を使用します。

直接法

直接法は一段階染色法であり、組織切片中の抗原と直接反応する標識抗体(すなわち、FITC標識抗血清)を含みます。この技術は一つの抗体のみを使用し、手順は短く迅速です。しかしながら、信号増幅がほとんどないため感度が低く、間接法の導入以来ほとんど使用されていません。

間接法

間接法は、組織抗原と反応する非標識一次抗体(第一層)、一次抗体と反応する標識二次抗体(第二層)を含みます(注:二次抗体は、一次抗体を産生させる動物種のIgGに対してでなければなりません)。この方法は、一次抗体上の異なる抗原部位とのいくつかの二次抗体反応によるシグナル増幅のため、より敏感です。さらに、1つの標識第二層抗体が多くの第一層抗体(同じ動物種から産生させられた)と共に異なる抗原に使用できるので、経済的でもあります。第二層抗体は、FITC、rhodamineまたはTexas redなどの蛍光色素で標識することができ、これは間接免疫蛍光法と呼ばれています。また、第二層抗体は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどの酵素で標識することもでき、これは間接免疫酵素法と呼ばれています。

PAP法(peroxidase anti-peroxidase method)

PAP法は、間接法のさらなる発展であり、抗ペルオキシダーゼウサギ抗体である第三層を含み、peroxidaseと結合して非常に安定なペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ複合体を作製します。ウサギのgaba-globulinおよびペルオキシダーゼからなる複合体は、第三層抗原として作用し、第二層の非標識ヤギ抗ウサギgaba-globulinに結合するようになります。ペルオキシダーゼ分子は抗IgGに化学的に結合するのではなく、免疫学的に結合しているため、その酵素活性を失うことなく、感度も約100〜1000倍高いです。また、非常に高い一次抗体希釈度が可能であり、したがって、多くの望ましくない抗体を除去し、非特異的バックグラウンド染色を減少させることができます。

ABC法(アビジン-ビオチン複合体法)

標準的なIHC法であり、免疫組織化学染色において広く用いられている技術の1つです。大きな糖タンパク質であるアビジンは、ペルオキシダーゼまたはフルオレセインで標識することができ、ビオチンに対して非常に高い親和性を有します。低分子量ビタミンであるビオチンは、抗体などの様々な生体分子に結合することができます。この技術は3つの層を含みます。 第一層は、標識されていない一次抗体です。 第二層はビオチン化二次抗体です。第三層は、アビジン - ビオチンペルオキシダーゼの複合体です。 次いで、ペルオキシダーゼは、DABまたは他の基質によって発色され、異なる比色最終産物を産生します。

LSAB法(標識ストレプトアビジンビオチン法)

Streptococcus avidini由来のストレプトアビジンは、アビジンの代替えとしての最近の革新です。ストレプトアビジン分子は、10の等電点を有するアビジンとは異なり、動物組織に対して荷電していないので、組織への静電結合は排除されます。さらに、ストレプトアビジンには、組織レクチンに結合し、何らかのバックグラウンド染色をもたらす可能性のある炭水化物基が含まれません。標識ストレプトアビジンビオチン法は、標準的なアビジン-ビオチン複合体法と技術的に似ています。第一層は非標識の一次抗体です。 第二層はビオチン化二次抗体です。第三層は、アビジン - ビオチンペルオキシダーゼ複合体を置換するための酵素 - ストレプトアビジンコンジュゲート(HRP-ストレプトアビジンまたはAP-ストレプトアビジン)です。基質色原体溶液を適用し、異なる比色最終産物を生成させることにより酵素を可視化します。蛍光標識が好ましい場合、第三層としては、FITC-ストレプトアビジンなどの蛍光色素 - ストレプトアビジンもオッケーです。最近の報告では、標識ストレプトアビジンビオチン法は標準的なアビジン-ビオチン複合体法より約5-10倍高感度であることが示されています。