フローサイトメトリー (FCM) /FACS | 滴定と比例

フローサイトメトリーは、異なる細胞上の膜タンパク質の相対発現に関する定量的情報を提供するすることが可能である。例えば、刺激された細胞が休止状態の細胞と比べ、与えられたタンパク質をより多く発現するかどうかについて調べられる。フローサイトメトリーデータから定量的な結論を引き出すためには、染色された細胞の蛍光強度が測定しているタンパク質に直接的かつ直線的に比例することを確認する必要がある。これは限定されない試薬の濃度を使用することを含み、細胞の染色強度が、存在する細胞の数でもなければ、使用された試薬の正確な量におけるピペッティングの不正確さでもなく、細胞上のタンパク質の量に関連する。使用する染色液の量を決定することは、各抗体試薬を滴定することにより、反応の時間内に飽和に近づく濃度を見つけることを含む。低い親和性/結合力抗体では、合理的な抗体濃度で短い染色時間では厳密な飽和が不可能なことがある。このような抗体では相対強度に関する結論を引き出しにくいかもしれない。

飽和濃度を決定するには、抗体の半希釈希釈液を用いて滴定曲線を実行し、製造者(もしあれば)が薦めた範囲の上下をカバーする。関心のある抗体と、濃度とアイソタイプが一致する無関係の抗体の両方の1:2希釈シリーズ(10 halving dilutionを使用する)を調製する。次いで、10 dilutionからの無関係の抗体および関心のある抗体の両方を用いて、標準的な染色プロトコルで細胞を染色する。あなたの最終作業濃度として、強度プラトーとなる染色液の希釈率をよく選んでください。その希釈率では、染色液の濃度の小さな変化が細胞の蛍光強度にほとんど影響しない。しかし、非常に高い抗体濃度は万能薬ではない。通常、高い抗体濃度での染色は低い濃度の場合ほど効果的ではない。さらに、コントロール抗体で染色された細胞から分かるように、ネガティブコントロールでさえ、高抗体レベルで非特異的に染色されることが多い。ここで重要なことは、シグナル対ノイズ比を最大にすることである。つまり、陽性抗体は最大に染色されるが、対照抗体はほとんど染色されないというような、プラトーとなる濃度を使用する。

間接染色では、一次抗体にしても二次抗体にしても、halving dilutionで滴定するが必要である。この方程式にはあまりにも多くの未知数があるように見えるかもしれないが、一次抗体の1つの妥当な濃度が存在する。その濃度の一次抗体で二次抗体のhalving dilutionを滴定し、次いで、最適の濃度の二次抗体で全ての一次抗体を順番に滴定する。非特異的染色は高抗体濃度で増加するので、二次抗体を滴定する場合、一次抗体ありおよびなしでの細胞の染色を比較することが特に重要である。一次抗体なしで、二次抗体のみで染色された細胞は「secondary control」として知られている。直接標識抗体を滴定する場合と同様に、シグナル対ノイズ比を最大にする二次抗体レベルを使用することが望まれる。即ち、一次抗体が存在する場合には飽和シグナルを与えるが、一次抗体が存在しない場合にはシグナルがほとんどない。

染色濃度が飽和に達する時、存在する染色液の量はほとんど制限されない。すなわち、通常、遊離抗体の濃度を有意に低下させることなく、全ての細胞上の全ての関連する細胞タンパク質を染色するのに十分な抗体が存在する(この計算の例については、KantorおよびRoedererをご参照ください)。したがって、細胞の数は、染色強度の鍵でもなく、懸濁液の量でもない。妥当な染色時間内に結合抗体と非結合抗体との間の有効な平衡が達成されるように、十分に高い濃度の抗体が必要なだけである。