フローサイトメトリー (FCM) /FACS | 細胞数

フローサイトメトリーの細胞数

各サンプルには、10^5〜10^6個の細胞が必要である。エラー(染色と洗浄工程のうちにいつも予想以上に多くの細胞を失う)の余地を与えるために、フローサイトメトリーを初めて行う方は、より多くの細胞を使用してください。1回の実験の結果を最大にするために、余りにも少ない細胞をあまりにも多くのサンプルチューブに分散しようとする試みはほとんどの場合、かえって結果がまったくないことを引き起こす(このような状況はすべての人に起こる)。

染色および洗浄の後、サイトメーター上でのサンプル取り込みの立体配置に従って、細胞ペレットを0.3-1.0mlに再懸濁する。可能な限り小さな容積を使用してください。 細胞があまりにも速く流れる場合、懸濁液は後で常にバッファーで希釈することができる。サイトメーターでは、細胞が約100-1000細胞/秒でサイトメーターを通過するように、必要に応じてより多くのバッファーで細胞のこの最終濃度を調整する。100細胞/秒よりも遅いのは非常に退屈である。毎秒1000個以上の細胞が問題を引き起こす可能性がある。なぜなら、コンピュータが追いつけないか、または、レーザビーム内で互いに近接している2つの細胞が単一の「事象」としてサイトメータに見られる可能性があるからである。細胞濃度の調整に関する制約は使用可能な細胞の総数とサイトメーターが処理できる最小容積に由来する。一般に、高濃度の細胞が望まれる。こうすると、可能な限り低い圧力を使用して、それらをサイトメーターに押し込むことができる (依然として1000細胞/秒に近い流量を達成する)。この高い流速を達成するために、細胞をあまりにも強く押すと、強度分解能に有害な影響を及ぼす。(フローストリームのサンプルコアを広げることによって)。新しい手順を設定している場合や機器の設定を調整する必要がある場合は、より大きい容積とより多くの細胞を有するいくつかの余分なコントロールサンプルを有することが特に有用である。

データの収集を開始する前に、最初にこれらの細胞を集めることにより、FSCおよびSSCパラメータを調整する時間が与えられる。こうするとすべての細胞がスケール通りになり、バックグラウンド蛍光が蛍光スケール上の適切に低い位置にあることを確認し、そして必要であればマルチカラー解析のためにコンペンセーションをチェックすることもできる。