フローサイトメトリー (FCM) /FACS 適用 |アポトーシス

アポトーシスはプログラム細胞死としても知られ、多細胞生物の発生および健康の正常な過程である。急性細胞傷害に起因する外傷性細胞死の形態の1つである壊死とは対照的に、アポトーシスは、制御、調節されたプロセスであり、生物の生命周期中に利点を与える。アポトーシスの間に、小疱形成、細胞の縮み、核の断片化、染色質凝縮、および染色体DNAの断片化を含む一連の変化が起こっている。アポトーシスは複数の状況で機能する。発生において、アポトーシスは形状の定義を可能にする。例えば、胎児の手の指は翼状であるが、細胞が死ぬと指の間の組織が分離する。また、天然の抗癌メカニズムとしても有益である。細胞のDNAが損傷されると、細胞にアポトーシスを起こし、その生物の健康状態を保持することができる。疾患のために修復不能に損傷された細胞にもアポトーシスを起こす。

アポトーシスにおける以下の特徴は、フローサイトメトリーを用いて観察することができる。

細胞の縮み

前方散乱光(FSC)はレーザー光の軸に対して前方向の小さい角度で散乱する光であり、細胞の大きさに関連する。側方散乱光(SSC)はレーザー光の軸に対して約90°の角度で散乱する光であり、細胞膜と細胞の内部構造の屈折率に関連する。アポトーシスが起こると、細胞の縮み、核濃縮、および粒子の量の増加が同時に起こる。したがって、FSCの減少およびSSCの増加は、フローサイトメトリーによって観察できる。 壊死細胞においては、FSCおよびSSCは両方とも増加する。

細胞膜の変化

初期のアポトーシスでは、細胞膜の内側に位置するホスファチジルセリン(PS)残基が細胞の外表面に露出する。アネキシンVはヒト血管抗凝固剤であり、PSに対して高い親和性を有する。アネキシンV-FITC / PI染色法は、早期アポトーシスの検出において広く用いられている。

DNA量の変化

アポトーシスの後期において、エンドヌクレアーゼは、クロマチン構成の単位の1つであるヌクレオソーム間のリンカーを破壊する。その結果、大きさが約180bpのオリゴマーである多数の小さいDNA断片が細胞内に蓄積する。細胞がエタノール中で固定され、その後再水和されると、より低分子量のDNAの一部が浸出し、DNA量を低下させる。DNAヒストグラムにおいて、これらの細胞は「sub-G1」ピークとして観察することができる。

DNA分解

分解されたDNA中のニックの存在は、末端デオキシヌクレオチド転移酵素によって認識することができる。末端デオキシヌクレオチド転移酵素はその後、dUTPの添加を触媒する。フローサイトメトリーによって視覚化するために、dUTPはFITCで標識することができる。この方法はTUNELとして知られ、後期アポトーシス細胞を効果的に検出することができるが、壊死に瀕している細胞または重度のDNA損傷を受けている細胞を標識する可能性もある。従って、主に後期アポトーシス細胞を標識するという目的を達成するために注意深く行うべきである。

カスパーゼの活性化

カスパーゼは、アポトーシスにおいて重要な役割を果たすシステインプロテアーゼファミリーに属する。哺乳動物細胞には、アポトーシスの初期段階に関与することが示されているいくつかのカスパーゼが存在し、例えばカスパーゼ2、カスパーゼ3、カスパーゼ6、カスパーゼ7、カスパーゼ8、カスパーゼ9およびカスパーゼ10である。これらの酵素の機能はまだ完全には明らかではないが、細胞がアポトーシスを起こす最初のシグナルを受けた後、アポトーシスカスケードの活性化、増幅および実行に責任を持つ。

カスパーゼは3つの方法で検出られる。
・特異的抗体を用いて酵素の活性型を検出することにより;
・カスパーゼの活性部位に結合する、蛍光色素標識された阻害剤ペプチドを用いることにより;
・非蛍光基質を用いることにより。酵素が活性である場合、蛍光産物を生じる。

その他の変化

他の方法もアポトーシスの検出に使用することができる。例えば、ローダミン123(Rh123)は、ミトコンドリア膜電位の変化を検出することができる。アクリジンオレンジ(AO)は、リソソームのプロトンポンプ機能を検出することができる。 ssDNAモノクローナル抗体は、アポトーシス細胞を特異的に認識することができる。P53、C-myc、Fas抗原、TNF、bcl-2ファミリー、サイクリンおよびrasのような他のアポトーシス関連タンパク質もアポトーシスの検出に使用することができる。