フローサイトメトリー (FCM) / FACS 抗体は優れた感度を有します

抗体親和性

過免疫 の動物由来のポリクローナル抗体は、特定の抗原上で認識するエピトープだけでなく、抗原の異なるエピトープに対する親和性も異なる。 抗体の内在親和性、または抗体と抗原相互作用の強さは、抗体分子の超可変(HV)領域に存在する。 これは、特異性を決定する分子の領域またはアミノ酸の配列である。 しかし、特異性が大きければ大きいほど親和性が強いとは、おそらく単純化しすぎている。 抗体と抗原との共有結合は起こらない。 抗体および抗原を一緒に保持する力には、イオン相互作用、水素結合およびファンデルワールス力が含まれる。 これらの力は、抗体と抗原との間の内在親和性に寄与する主要な因子である。

結合定数(Ka)は、抗体とその抗原決定基との間の結合の強さを表す。 これは、抗体の親和性の尺度である。 抗体の親和性が高いほど、抗体の利用可能な結合部位が飽和(平衡に達する)になるために必要な遊離抗原の濃度が低くなる。 抗体および抗原結合のKaの範囲は1モルあたり103~1010リットルであり、これは濃度の逆数(1リットルあたりのモル数)である。

抗体の量(力価)が免疫化の間に時間と共に増加するのと同様に、その質(親和性)も増加する。これを「抗体親和性の成熟」と呼んでいる。 低用量の免疫原は親和性成熟の速度を増加させるが、抗体の力価をより低くする。逆もまた同じである。

抗体が細胞抗原との平衡または飽和に達するのに要する時間は機能親和性とも呼ばれ、フローサイトメトリー分析のための最適な染色を決定する際の重要な因子である。同じ力価の2つの抗体(または抗血清)の等しいアリコートを細胞抗原と共に絶えず増加する時間インキュベートすると、最大染色強度のプラトーに最初に到達する抗体は、より高い機能親和性を有する。「結合活性」という用語は機能的親和性と同義であり、抗体とその抗原との間の結合の強さを示すために使用されて、ポリクローナル抗体集団に見出される全ての内在親和性の総和を記載するためにもよく使用される。

抗原-抗体反応は可逆的であるため、細胞上に形成した単純な免疫複合体は、フローサイトメトリーの洗浄サイクル中に解離することがある。疎水性は、複合体の疎水性基を一緒にする水の能力であり、抗体 - 抗原複合体に対して安定化効果を有するようである。したがって、抗体 - 抗原複合体は、塩濃度、pHおよび/または温度の変化に影響され得る。解離の容易さおよび程度は抗体によって異なり、低塩濃度および低温は既に形成した免疫複合体の解離による弱い染色の可能性を減少させる。したがって、高親和性抗体は理想的であり、しかも洗浄中に、低親和性抗体よりも解離が起こりにくいという利点を有する。前述のように、抗体のポリクローナル集団は、所与の抗原上のいくつかのエピトープに対する低親和性から高親和性までの多かれ少なかれ連続スペクトルを含む。

例えば、

  推薦濃度 1:10 1:100  
SBI ヒトCD14-MM06H 抗原: ヒトCD14
抗体: CD14 抗体 (FITC), マウス MAb (10073-MM06-F)
細胞: ヒト全血単球
Flow Cyt: 10^6の細胞は10µlを使用する。
機器: BD FACSCalibur
    単球    

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フローサイトメトリー / FACSの背景知識

フローサイトメトリーは細胞膜タンパク質および細胞内タンパク質ならびにペプチドおよびDNAを評価する方法である。FACSの原理は抗原抗体反応であり、抗体が蛍光標識されている。抗体に結合する蛍光タンパク質は3つ(R-PE、APC、およびPerCP)存在する。フローサイトメトリー定量は、挿入するカラー標識(抗体なし)を用いて行う。フローサイトメトリー抗体は、細胞計数、細胞分取、バイオマーカー検出およびタンパク質工学に広く使用される。