ウエスタンブロットデータの解析

デンシトメトリーウェスタンブロット

ウェスタンブロットスキャンはグレースケールに変換してJPEGファイルとして保存する必要があります。

1) ImageでWesternスキャンを開きます。

2)「rectangular selection」(ファイルメニューの下)をクリックし、目的のバンドの周りのボックスを選択します。 可能であれば、背景を避けてください。 同じボックスのサイズは、測定したいすべてのバンドに適合できる必要があります。

3)あなたが一つのエリアをボックスしたら、「analyze」ドロップダウン・メニューに行きます。「measure」を選択します。 結果ボックスをポップアップするはずです。

4)矢印カーソルを使用して、ボックスを次の目的のバンドに移動し、「measure」を繰り返します。

5)すべてのタンパク質バンドの測定が終わったら、ボックスをバックグラウンドに移動します。 バックグラウンドブロットの面積を(同じ方法で)測定します。バックグラウンドがやや染みだらけで、色が不均一な場合は、タンパク質バンドの周りに相当するバックグラウンド領域を選択すべきです。

6) すべての測定が終了したら、「all」(コントロールA)と「copy」(コントロールC)を選択し、Excelに貼り付けます。

7) Excelの中で、平均値を除くすべての値を消去します。 すべての平均値を255から引きます(バックグラウンドを含む)。 次に、各バンド値からバックグラウンドを引きます。これはバンドの強度です。
例えば
バックグラウンド平均値 = 189.527
試料 A, 平均値= 120.977
試料B , 平均値= 109.877
255から引く
バックグラウンド平均値= 65.473
試料A, 平均値= 134.023
試料B , 平均値= 145.123
バックグラウンド を引く
試料A = 68.55 =強度
試料B = 79.65 =強度

8) 各タンパク質バンドの面積を計算します。Imageの中でブロットを再オープンします。「image」ドロップダウンメニューに行きます。下へスクロールして「adjust」し、「threshold」を選択します。スレッショルドボックスがポップアップします(ブロットが赤色になっている可能性があります)。バーカーソルを一番左にドラッグします(ブロットは画素化しないべきです)。タンパク質バンドがすべてそれに合うように赤色に画素化されるまで 、下のバーカーソルをゆっくりと右にドラッグしてください。 バンドが完全に赤く塗りつぶされたら、「Apply」ボックスを押してから「OK」ボックスを押します。 バンドは白い背景に黒色で表示されるはずです。

9) 黒いバンドの周りの矩形ボックスを選択することによって、タンパク質の面積を測定します(各バンドの間のボックスサイズを調整することができます)。「analyze」メニューに行き、「histogram」を選択します。ヒストグラムボックスがポップアップするはずです。count、mean、std dev、min、max、modeなどの値が表示されます。これらを無視してください。コンピュータのマウスカーソルをY軸の0に置いてください。「value」と「count」数値がボックスの下部に表示されます(カーソルがy軸上にあるときのみ)。excelに「count」ナンバーを記録してください(これはあなたのバンドのエリアです)。

10) Excelの中の各タンパク質バンドの面積を記録します。 強度に面積を掛けて、これは「integrated pixel value」です。
Sample A = 68.55 (intensity) x 411 (count) = 28174.05
Sample B = 79.65 x 770 = 61330.5
integrated pixel valueは大きいので、103と表現する。
Integrated pixel value x 103 Sample A = 28.1
Integrated pixel value x 103 Sample B = 61.3