化学発光ウェスタンブロット検出

化学発光ウェスタンブロットは標的タンパク質に対する一次抗体、続いてHRP(ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ)酵素標識二次抗体でプローブします。HRP酵素の化学発光基質は注意深くブロットにアプライし、HRP酵素が基質を修飾するときに光を放出します。写真のフィルム、またはデジタルCCDカメラを使用するイメージングシステムは、放出された光を画像として取り込みます。最も重要なことは、化学発光は利用可能な検出方法の中で最大の感度を産生します。

化学発光ウェスタンブロット検出の原理:

最も一般的なウェスタンブロット基質はルミノールに基づくもので、化学発光シグナルを生成します。化学発光は、光の形態で放出するエネルギーを生成する化学反応です。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP)および過酸化物バッファーの存在下で、ルミノールは酸化し、425 nmで発光する3-aminophthalateと呼ばれる励起状態生成物を形成します。この生成物は基底状態に減衰すると発光が終わります。光の放出は酵素 - 基質反応の間にのみ起こり、したがって酵素の近くの基質が使い尽くすと、シグナル出力は止まります。 対照的に、DABのような比色基質は、反応が終了したとしても膜に可視の沈殿物を生成します。HRPに使用可能の化学発光基質はいくつかあり、化学発光ウェスタンブロットに異なるレベルの感度を提供します。

Chemiluminescence Western Blot detection
膜上のタンパク質の化学発光検出

化学発光ウェスタンブロット検出のイメージングオプション

光にさらすと、X線フィルムに画像が刻印されます。フィルムに到達する光量が画像を決定し、より明るく、より強い光がより強い画像を生成します。 ウエスタンブロッティングでは、この光は化学発光または放射性シグナルで標識したタンパク質から来ます。化学発光標識では、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識二次抗体が増強化学発光(ECL)試薬と反応して発光します。 X線フィルム上のインプリントの強度は信号に比例します。 言い換えると、このシグナルはウエスタンブロット膜上に存在するタンパク質の量に関係しているため、定量が可能です。

CCDカメライメージングは化学発光と蛍光検出に適しています。 この技術は、必要に応じて光源を使用して膜を照らすか、または特定の波長で発蛍光団を励起します。 レンズは、イメージングフィールドから得られた光を集光し、それを二次元CCDアレイに集束させます。 得られるデジタル画像は、本質的に化学発光反応または蛍光染料からの光に比例した電荷のパターンです。 画像の強度は生成した光量に比例し、タンパク質の量を示します。

また、Sino BiologicalはHRP酵素で標識した一連の二次抗体を提供しています。 これらの二次抗体は、化学発光ウエスタンブロット検出に使用することができます。

化学発光ウェスタンブロット検出のイメージングオプション

  X線フィルム CCDカメラ
長所 • 感度が高い
• 柔軟な露光時間、弱い信号を検出できる
• リニアダイナミックレンジが広い
• 感度が高い
• 定量的イメージング
• デジタル画像を生成する
短所 • リニアダイナミックレンジが狭い
• 暗室が必要
• CCD冷却測定が必要